Summary
Microcontact utskrift används i stor utsträckning att mönstret proteiner och andra molekyler på material ytor. Vi visar de grundläggande stegen i denna process, prägling mönster av fibronektin på glas.
Abstract
Förmågan att mönstret proteiner och andra biomolekyler på substrat är viktigt för att fånga den rumsliga komplexiteten i den extracellulära miljön. Utveckling av microcontact utskrift av Whitesides gruppen (
Protocol
1. Beredning av lösningar och material
Dessa åtgärder bör utföras flera dagar i förväg.
- Glas täckglas. Täckglas städades genom nedsänkning i 10 minuter i en lösning av Linbro 7X rengöringsmedel: vatten, blandat med en 1: 3 ratio och värme, med omrörning tills klart. Täckglas var sköljas mycket med avjoniserat vatten och sedan bakas i 450 ° C i 6 timmar. Laddar täckglas i keramiska färgning rack (se reagenser) förenklat denna process.
- Protein lösning för stämpling. Rekonstituera fibronektin följa tillverkarens anvisningar för att en stamlösning 1 mg / ml koncentration.
2. Maska stämplar från den topologiska mästare
Dessa steg kan utföras flera dagar i förväg. Förvara frimärken mönster upp i en täckt skål, som en vävnadskultur maträtt.
- Ta bort löst damm från mästare med hjälp av en ström av komprimerade, filtrerad luft eller inert gas.
- Placera befälhavaren, mönstrade sidan uppåt, i botten av en plast skål bara större än befälhavaren. 60 - eller 100-mm vävnadsodling rätter är väl lämpade för detta ändamål.
- I ett polystyren 50 ml centrifugrör, kombinera Sylgard komponenterna i förhållandet härdare: elastomer bas 1: 10 i vikt. Blanda noggrant med en plast-enhet, t.ex. en engångspipett. Bered minst 0,2 ml elastomer per kvadratcentimeter av maträtt området.
- Centrifugera 50 ml tub vid 300 G i 5 minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Häll elastomer över master, placera sedan i en torkapparat, under vakuum, i 30 minuter.
- Bota elastomer i ugn vid 65 ° C i minst 2 timmar. Härdning vid högre temperaturer och för längre tider ger styvare elastomerer. Låt svalna till rumstemperatur.
- Separera ark med stämplar från befälhavaren.
3. Microcontact utskrift av fibronektin på glas
- Klipp ut en enda stämpel. Frimärken mäter 4 mm x 4 mm till 1 cm x 1 cm i området och 1 - 2 mm tjock är lättast att börja med. Placera mönstret uppåt på en glasplatta eller små plast fat.
- Placera stämpel i en plasma renare och process, under vakuum, i 30 sekunder. En Harrick vetenskaplig plasma renare (se utrustning), som på sin högsta effekt inställning kommer att göra PDMS ytan hydrofil. Längre tider resulterar i sprickor i elastomer.
- Späd fibronektin lösningen med avjoniserat vatten till en stämpling koncentration av 50 mikrogram / ml.
- Placera en liten droppe (10 - 50 l) för stämpling lösningen på stämpeln. Den kommer att spridas över den hydrofila ytan. Tillsätt bara tillräckligt lösning att släppa täcker stämpel, men inte köra över kanter. Låt protein absorberas starkt till stämpel i 5 minuter.
- Med hjälp av en Kimwipe ® eller annan ren pappersnäsduk, veke av sig det mesta av proteinet lösning från stämpeln, utan att röra det mönstrade området.
- Torka återstående lösningen från stämpeln i en ström av ren, torr, inert gas, som kväve.
- Använda pincett, ta bort stämpeln från glasskiva, invertera, och placera i kontakt med rengjorda glas täckglas (den yta som ska mönstrade). Lägg en tyngd ovanpå för att främja god kontakt. De specifika vikt som ger den bästa mönster är beroende av stämpeln storlek och mönster, börja med en 5 g vikt och justera mellan stansrester. Lämna stämpel i kontakt med yta för 1 minuter.
- Försiktigt isär stacken, och separat stämpel från täckglas.
- Kraftigt skölj mönstrade täckglas i PBS, följt av avjoniserat vatten, för att ta bort protein som inte adsorberas till ytan. Torr täckglas under en ström av kvävgas.
Representativa resultat
Microcontact utskrift är en kraftfull process för mönstring molekyler på ytor. Denna process har förmågan att skapa funktioner med dimensioner alltifrån tiotals mikrometer till hundratals nanometer, i bild. 1A, logotyper till vänster är var 200 nm i höjd, medan de gröna fläckar som illustreras i figur. 1B är 1 mikrometer i diameter och placerade på 4 ìm intervall, mätt centrum till centrum. Fig.. 1B visar också en stark egenskap hos microcontact utskrift, nämligen att det är och additiv process. Flera rundor av microcontact utskrift kan användas till en enda yta för att skapa flerkomponenttyp system 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den microcontact tryckprocessen är konceptuellt enkel och mycket robust, efter att ha tillämpats på mönstring ett brett spektrum av molekyler på olika substrat. Dock fortfarande processen något av en konst. Den specifika geometri mönstret som ska skapas, protein vara mönstrade, tillämpas vikt och beläggning / stämpling förhållanden påverkar alla stämpling kvalitet. Till exempel, för lite vikt, tillämpas på stora drag, ofta resulterar i luckor i mönster som kan ses i övre högra logotyp FIG. 1A. Omvänt kommer för mycket vikt orsakar hängande och kollaps av den stämpeln, vilket resulterar i oönskade nedfall av protein i regionerna mellan mönstrade features.As ett andra exempel, specifika proteiner (till exempel antikroppar) mönster med bättre återgivning om plasma behandling steg utelämnas lämnar PDMS hydrofila. Stämpling av fibronektin på glas presenteras här som en utgångspunkt för sådana ändringar och optimeringar, vilket visar de grundläggande teknikerna i denna process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-32G | ||
| Desiccator | Nalge Nunc international | 5315-0150 | ||
| PBS | Reagent | Invitrogen | 10010-072 | |
| Protein labeling kit | Reagent | Invitrogen | A30006 | |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| Staining rack | Reagent | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Coverslips | Reagent | Fisher Scientific | 12-544-12 | |
| Sylgard 184 | Reagent | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Diffraction Grating | Reagent | Edmund Scientific | 3040267 |
References
- Chen, C. S. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1425 (1997).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching. Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).
- St. John, P. M. Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).
- Kam, L., Boxer, S. G. Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes. Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).
- Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).
- Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).
- Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).
