Summary
באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע.
Abstract
באופן מסורתי פרוסה האנכי והכנת כל הר של הרשתית שימשו ללימוד פונקציה של מעגלים הרשתית. עם זאת, רבים של נוירונים ברשתית, כגון תאים amacrine, להרחיב הדנדריטים שלהם בצורה אופקית, כך מורפולוגיה של תאים אמור להינזק קשות פרוסות אנכי. לקראת כל הר, במיוחד עבור תיקון-clamp הקלטות, הנוירונים ברשתית בשכבת הביניים אינם נגישים בקלות בשל הסיקור הנרחב של גליה (תאים מולר) endfeets של התא. כאן, אנו מתארים את הרומן חיתוך שיטה לשמר את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים ברשתית ללא פגע. פרוסה נעשתה אופקית על השכבה הפנימית של הרשתית באמצעות מבצעה vibratome אחרי הרשתית היה מוטבע נמוכה טמפרטורת ההתכה agarose ג'ל. בהכנה זו פרוסה האופקי של הרשתית, למדנו את תפקוד הנוירונים ברשתית בהשוואה המורפולוגיה שלהם, באמצעות תיקון-clamp הקלטה, טכניקת הדמיה סידן, immunocytochemistry, ואת תא בודד RT-PCR.
Protocol
- הכן לחסום אגר (30 מ"ג / מ"ל, 3%, כלומר במים מזוקקים). ממיסים במיקרוגל ועל זה קודם ושופכים אותו לתוך צלחת זכוכית. שמור את המנה במקרר ב 4 o C.
טיפ: הבלוק אגר אמור להיות מוכן מראש.
- הכן בטמפרטורה נמוכה ההיתוך agarose ג'ל (25 מ"ג / מ"ל, 2.5% כלומר, בינוני). ממיסים במיקרוגל ועל זה. שמור את זה באמבט מים חמים על 35 ° C.
טיפ: שמרו על ג'ל agarose לא חם מדי. אם זה חם מדי, זה לוקח זמן רב להיות הקרושה, ג'ל עשוי להרוג את הרשתית
. - להרדים את enucleate, חיה גלגל העין ופתח אותו כמו עיינית. כדי לנזל הומור זגוגי, עיינית נפתחה ספוגה במשך 10 דקות ב hyaluronidase במדיום (0.07 מ"ג / מ"ל), אם בהכרח.
- חותכים את אגר לגוש (למשל, 1 ס"מ X 1.5 ס"מ הרשתית העכבר) ו מחובר היטב על ידי דבק מיידית על הבמה vibratome. שמור את בלוק אגר רטוב.
- מניחים את להב ב 5 מעלות על מבצעה. בעדינות לחתוך את המשטח העליון של לחסום את אגר במהירות של כ. 50 מיקרומטר / sec, freq. 50 הרץ.
טיפ: ודאו כי המשטח העליון של לחסום את אגר חלקה לגמרי שטוח. כמה חתכים (לפחות 3 פעמים) עשוי להיות נחוץ כדי לקבל את משטח חלק ושטוח של גוש אגר.
- שוטפים את עיינית עם המדיום ללא hyaluronidase. לבודד את הרשתית של אפיתל הפיגמנט ולמקם אותו photoreceptor בצד על נייר הסינון. כדי בתוקף לצרף את הרשתית לנייר סינון, ואקום הרשתית על הנייר מסנן מספר פעמים.
טיפ: ודא הרשתית מחובר נייר הסינון שטוח לחלוטין. לאחר לשים הרשתית על הנייר לסנן, לחתוך את נייר הסינון עודף סביב הרשתית (Fig.2A). העיתון לסנן עודף לעתים קרובות מונע להב מללכת לתוך שכבת המתאים של הרשתית.
- נגב בעדינות את עודף בינוני ברחוב אגר ובזהירות המקום הרשתית על הנייר סינון לחסום את אגר. כדי בתוקף במקום נייר סינון לחסום את אגר, דבק לצרף מיידית על קצה נייר הסינון.
עצה: כדי להימנע סדק unexpectable, המקום הרשתית כחזית ככל האפשר על פני השטח העליון של לחסום את אגר.
- יוצקים בעדינות את הג'ל בטמפרטורה נמוכה ההיתוך agarose על הרשתית. חכו דקות 1 בעדינות לשפוך את המדיום בו כדי לצנן אותה. הג'ל הופך agarose הקרושה במהירות.
טיפ: חם מדי agarose ג'ל הורג את הרשתית.
- הרם את עמדת להב מיקרומטר כמה מאות מעל המשטח העליון של גוש אגר בעדינות לחתוך את החלק העליון של הקרושה agarose ג'ל.
- תחתון למטה את המיקום להב. חותכים את הרשתית ברמה של הפרוקסימלית שליש שכבת הגרעין הפנימית (בערך בין 200 לבין 250 מיקרומטר מעל המשטח העליון של גוש אגר).
טיפ: מהירות רבה מדי של הלהב יפגע קשות ברשתית. כ. 50 מיקרומטר / sec (50 הרץ) המתאים.
- שימו לב כי תאים amacrine עכשיו עם הפנים כלפי מטה. בזהירות להרים את הפרוסה של הרשתית יחד עם הקרושה agarose ג'ל ולמקם אותו עם הפנים כלפי מעלה בתא או צלחת.
טיפ: מכיוון הרשתית העכבר הזעיר וגלי, קשה לקבל פרוסת אופקי מושלמת שכבת המתאים. פרוסת "עקיפה" עשוי להיות שיטה חלופית כדי לקבל את פרוסת שטוח יחסית של הרשתית. כדי לקבל את פרוסת אלכסונית, לשים עוד נייר מסנן בין הרשתית על הנייר לסנן את הבלוק אגר כפי שמוצג Fig.2B. למרות שלא ניתן לצפות פרוסת אופקי מושלם, תמיד יש כמה תחומים שבהם סומה תא amacrine הוא על פני השטח של הפרוסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר יתרונות חשובים של הכנת החתך האופקי של הרשתית.
ראשית, מורפולוגיה של תאים דנדריטים להרחיב את אופקי, כגון תאים amacrine תאים אופקיים, נשמר. הוכח כי קיימים מעל 20 סוגים של תאים amacrine ברשתית (מקניל ו Masland, 1998), ולכן חשוב מאוד להשוות את המורפולוגיה של התאים עם הנכס פיזיולוגיים.
שנית, ברשתית כל הר, את הסיקור הנרחב של endfeets תא של גליה מונע גישה של pipettes תיקון לתאי amacrine. ב פרוסות אופקיות, סומה של תאים amacrine חשופה אל פני השטח של הפרוסות.
שלישית, ריאגנטים כימיים יכול בקלות להגיע אל התאים הממוקדים והדנדריטים שלהם, כי אלה נמצאים על פני השטח של הפרוסות. שטפי-in-ולשטוף מתוך כימיקלים מהירה וקלה.
רביעית, הדמיה יון ניאון כגון הדמיה סידן המקובלת היא performable. ב פרוסות אנכי המסורתית או את הרשתית כל הר, אור עירור הדמיה עצמה מפעילה את קולטני האור. בהכנת פרוסה אופקי, photoreceptors ו photopigments יוסרו לחלוטין כך שאין זיהום של עירור אור עורר חפצים. בנוסף, יחס אות לרעש של הדמיה הוא הרבה יותר גבוה, כי פעילות רקע של photoreceptors מסולק. החיסרון הגדול ביותר של הכנת החתך האופקי הוא הקשר האנכי בין photoreceptors ותאי גנגליון הוא חתך כך שאין עיבוד מידע חזותי בתוך הפרוסה.
טכניקה זו החלה על הרשתית של כל בעלי חיים סטנדרטיים כגון דגי זהב, העכבר ארנב (Fig.1B). השיטה של פרוסת האופקי עשוי להציע דרך חלופית לחקור את תפקוד הנוירונים המעגלים העצביים ברשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הפרוטוקולים הניסוי נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בבעלי חיים.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. Richard H. Masland ו Akimichi Kaneko שנתן לנו עצות ערך והצעות להקים את הליך הכנת הפרוסה האופקי של הרשתית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
