Summary
Traditionnellement, la tranche verticale et de toute la préparation de montage de la rétine ont été utilisés pour étudier la fonction des circuits de la rétine. Ici, nous décrivons le roman tranchage méthode pour préserver la morphologie dendritique des neurones rétiniens intacte.
Abstract
Traditionnellement, la tranche verticale et de toute la préparation de montage de la rétine ont été utilisés pour étudier la fonction des circuits de la rétine. Cependant, de nombreux neurones de la rétine, telles que les cellules amacrines, d'élargir leurs dendrites horizontalement, de sorte que la morphologie des cellules est censée être gravement endommagés dans les tranches verticales. Dans toute la préparation de montage, notamment pour les enregistrements de patch-clamp, les neurones rétiniens dans la couche intermédiaire ne sont pas facilement accessibles en raison de l'importante couverture des cellules gliales endfeets s (cellule de Mueller). Ici, nous décrivons le roman tranchage méthode pour préserver la morphologie dendritique des neurones rétiniens intacte. La tranche a été faite à l'horizontale à la couche interne de la rétine à l'aide d'une trancheuse vibratome après la rétine a été intégré dans le bas température de fusion gel d'agarose. Dans cette préparation tranche horizontale de la rétine, nous avons étudié la fonction des neurones de la rétine par rapport à leur morphologie, en utilisant patch-clamp, la technique d'imagerie calcique, immunocytochimie, et une seule cellule de RT-PCR.
Protocol
- Préparer un bloc de gélose (30 mg / ml, soit 3%, dans l'eau distillée). Dissoudre et micro-ondes c'est d'abord et versez-la dans un plat en verre. Gardez le plat au réfrigérateur à 4 o C.
Astuce: Le bloc de gélose doivent être préparés à l'avance.
- Préparer à basse température de fusion du gel d'agarose (25 mg / ml, soit 2,5%, en moyenne). Dissoudre et micro-ondes qu'elle. Gardez-le dans le bain d'eau chaude à 35 ° C.
Astuce: Conserver le gel d'agarose pas trop chaud. Si elle est trop chaude, elle prend beaucoup de temps pour être solidifié, et le gel peut tuer la rétine
. - Euthanasier l'animal, énucléer un globe oculaire et de l'ouvrir comme un œilleton. Pour liquéfier humeur vitrée, l'œilleton ouverture est trempé pendant 10 min dans l'hyaluronidase dans la moyenne (0,07 mg / ml), si nécessairement.
- Couper l'agar-agar dans un bloc (par exemple, 1 cm x 1,5 cm pour la rétine de souris) et fermement attaché sur une scène vibratome par de la colle instantanée. Gardez le bloc de gélose humide.
- Placez la lame à 5 degrés à la trancheuse. Doucement coupé la surface supérieure du bloc de gélose à la vitesse d'env. 50 um / sec, fréq. 50 Hz.
Astuce: Assurez-vous que la surface supérieure du bloc d'agar est totalement plat et lisse. Plusieurs coupes (au moins 3 fois) peut être nécessaire pour obtenir la surface lisse et plane du bloc de gélose.
- Rincer l'œillère avec le milieu sans hyaluronidase. Isoler la rétine à partir d'un épithélium pigmentaire et la place qu'il photorécepteur vers le bas sur un morceau de papier filtre. Pour fixer solidement la rétine pour le papier-filtre, le vide de la rétine sur le papier filtre à plusieurs reprises.
Astuce: Assurez-vous que la rétine est attachée à du papier filtre complètement plat. Après avoir mis une rétine sur le papier filtre, couper l'excédent de papier filtre entourant la rétine (Fig.2a). L'excédent de papier filtre empêche souvent d'une lame d'entrer dans la couche appropriée de la rétine.
- Essuyez doucement la moyenne supérieure sur le bloc d'agar et placer soigneusement la rétine sur le papier filtre sur le bloc de gélose. Pour placer la fermeté du papier filtre sur le bloc de gélose, joignez colle instantanée sur le bord du papier filtre.
Astuce: Pour éviter les fissures unexpectable, placer la rétine comme l'avant que possible sur la surface supérieure du bloc de gélose.
- Verser délicatement le gel à basse température de fusion d'agarose sur la rétine. Attendre 1 min et versez doucement le support sur elle pour la refroidir. Le gel d'agarose se solidifie rapidement.
Astuce: Trop chaud en gel d'agarose tue la rétine.
- Soulevez la position de la lame à plusieurs centaines um-dessus de la surface supérieure du bloc de gélose et doucement coupé le haut de la solidification du gel d'agarose.
- Plus bas sur la position de la lame. Couper la rétine au niveau de l'extrémité proximale d'un tiers de la couche nucléaire interne (environ entre 200 et 250 um-dessus de la surface supérieure du bloc de gélose).
Astuce: trop de vitesse de la lame d'endommager sévèrement la rétine. Env. 50 um / seconde (50 Hz) est approprié.
- Notez que les cellules amacrines sont maintenant face vers le bas. Soigneusement ramasser la tranche de la rétine avec le gel d'agarose solidifié et placez-le face vers le haut dans une chambre ou un plat.
Astuce: Parce que la rétine de souris est minuscule et ondulés, il est difficile d'obtenir une parfaite tranche horizontale à une couche appropriée. Un "oblique" tranche peut être une méthode alternative pour obtenir la tranche relatifs à plat de la rétine. Pour obtenir la tranche oblique, mettre un autre papier filtre entre la rétine sur le papier filtre et le bloc d'agar comme indiqué dans Fig.2b. Bien que vous ne pouvez espérer une tranche horizontale parfaite, il ya toujours quelques domaines où le soma des cellules amacrines est sur la surface de la tranche.
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Discussion
Il ya plusieurs avantages importants de la préparation tranche horizontale de la rétine.
Tout d'abord, la morphologie des cellules qui s'étendent horizontalement dendrites, comme les cellules amacrines et les cellules horizontales, est préservée. Il a été démontré qu'il ya plus de 20 types de cellules amacrines dans la rétine (MacNeil et Masland, 1998), de sorte qu'il est très important de comparer la morphologie des cellules avec la propriété physiologique.
Deuxièmement, dans la rétine toute monture, la couverture étendue des cellules gliales endfeets s empêche l'accès des pipettes de patch pour les cellules amacrines. Dans les tranches horizontales, le soma des cellules amacrines est exposée à la surface des tranches.
Troisièmement, des réactifs chimiques peuvent facilement atteindre les cellules cibles et de leurs dendrites, car elles sont situées à la surface des tranches. Lavez-in et de wash-out de produits chimiques sont rapides et faciles.
Quatrièmement, l'imagerie d'ions fluorescents tels que l'imagerie calcique conventionnelle est exécutable. Dans les tranches verticales traditionnelles ou de la rétine entière de montage, la lumière d'excitation pour l'imagerie s'active photorécepteurs. Dans la préparation de tranches horizontales, les photorécepteurs et photopigments sont totalement supprimés pour qu'il n'y ait pas de contamination d'excitation lumineuse évoqués artefacts. En outre, le rapport signal-bruit de l'imagerie est beaucoup plus élevé parce que l'activité de fond de photorécepteurs est éliminé. Le plus grand inconvénient de la préparation tranche horizontale est que connexion verticale entre les photorécepteurs et des cellules ganglionnaires est coupé de sorte qu'il n'ya pas de traitement des informations visuelles au sein de la tranche.
Cette technique est applicable à la rétine de tous les animaux standards tels que les poissons rouges, la souris et le lapin (Fig. 1b). La méthode de la tranche horizontale peut offrir une voie alternative à enquêter sur la fonction des neurones et les circuits neuronaux de la rétine.
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Disclosures
Tous les protocoles expérimentaux ont été menés conformément aux National Institutes of Health des lignes directrices pour l'utilisation des animaux.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs. Richard H. Masland et Akimichi Kaneko de nous donner des conseils et des suggestions utiles pour établir la procédure de la préparation de tranches horizontales de la rétine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
