Summary
Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar.
Abstract
Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, amacrine hücreleri gibi retinal nöronların, hücrelerin morfolojisi dikey dilimler halinde ağır hasarlı olması gerekiyordu ki, yatay dendritler genişletmek. Bütün montaj hazırlanmasında, özellikle yama klemp kayıtları için, orta tabaka retina nöronlar glial hücre (Müller hücre) ler endfeets geniş kapsama alanı nedeniyle kolayca erişilebilir değildir. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar. Retina düşük sıcaklık erime agaroz jel gömülü sonra dilim vibratome dilimleme makinesi kullanarak retinanın iç tabakası yatay olarak yapılmıştır. Retinanın bu yatay dilim hazırlanmasında, yama klemp kayıt, kalsiyum görüntüleme tekniği, immünhistokimya ve RT-PCR tek hücreli kullanarak, kendi morfolojisi ile karşılaştırıldığında retinal nöronların fonksiyonu okudu.
Protocol
- Agar bloğu (30 mg / ml, yani% 3, distile su) hazırlayın. Çözülür ve mikrodalga ilk ve bir cam tabak içine dökün. 4 ° C'de buzdolabında çanak tutun
İpucu: agar blok önceden hazırlanmış olmalıdır.
- Hazırlayın düşük sıcaklık eritme agaroz jel (orta, 25 mg / ml, yani% 2,5 'i,). Çözülür ve mikrodalga. 35 ° C'de sıcak su banyosunda tutun
İpucu: agaroz jel çok sıcak NOT tutun. Çok sıcak ise, bu katılaşmış olması için uzun bir süre alır ve jel retinanın öldürebilir
. - Hayvan, aydınlatmak bir göz küresi Euthanize ve Göz yuvası gibi açın. Vitreus mizah sıvılaştırılması için açılan Göz yuvası varsa mutlaka orta hiyalüronidaz 10 dakika (0.07 mg / ml) için ıslatılır.
- Agar (örn., 1 cm x 1,5 cm fare retina) bir blok halinde kesin ve anında yapıştırıcı vibratome bir sahnede sıkıca bağlı. Agar bloğu ıslak tutun.
- Dilimleme makinesi az 5 derece bıçak yerleştirin. Yaklaşık hızda agar bloğu üst yüzeyi hafifçe kesti. 50 mm / sn, frekans. 50 Hz.
İpucu: agar blok üst yüzeyi tamamen düz ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Bazı kesim (en az 3 kez), agar bloğu, pürüzsüz ve düz bir yüzey elde etmek için gerekli olabilir .
- Göz yuvası hiyalüronidaz olmadan orta ile durulayın. Retina pigment epitel izole etmek ve bir parça filtre kağıdı üzerinde fotoreseptör-tarafı aşağı yerleştirin. Filtre kağıdı sıkıca retina eklemek için, filtre kağıdı birkaç kez retina vakum.
İpucu: retina tamamen düz filtre kağıdı takılı olduğundan emin olun. Filtre kağıdı üzerinde bir retina koymak sonra, retina (Fig.2A) çevreleyen fazla filtre kağıdı kesti. Fazla filtre kağıdı, genellikle uygun retina tabakası girecek bir bıçak önler .
- Agar bloğu aşırı orta yavaşça silin ve agar blok dikkatlice filtre kağıdı retina. Agar blok filtre kağıdı sıkıca yerleştirmek için, filtre kağıdı kenarına anında yapıştırıcı takın.
İpucu: agar blok üst yüzeyi mümkün olduğunca ön unexpectable çatlak önlemek için, retinanın yerleştirin.
- Düşük sıcaklıkta eriyen agaroz jel retinanın üzerine yavaşça dökün. 1 dakika bekleyin ve yavaşça soğumasını orta dökün. Agaroz jel hızlı katılaşmış olur.
İpucu: Çok sıcak agaroz jel retinanın öldürür.
- Agar bloğun üst yüzeyinden birkaç yüz mikron bıçak pozisyonu kaldırın ve yavaşça katılaşmış agaroz jel üst kesim.
- Bıçak konum aşağı indirin. Retinanın iç nükleer tabaka (yaklaşık agar bloğun üst yüzeyinden 200 ila 250 mikron) proksimal üçte biri düzeyinde kesin.
İpucu: Çok fazla bıçak hızı ciddi retina zarar verecektir. Yaklaşık. 50 mm / sn (50 Hz) uygun olur.
- Amacrine hücreleri artık yüzü aşağı olduğuna dikkat edin. Dikkatle katılaşmış agaroz jel ile birlikte retina dilim pick up ve yüzü yukarı bir oda ya da bir tabak içinde yerleştirin.
İpucu: Fare retinanın küçük ve dalgalı olduğu için, mükemmel bir yatay dilim uygun bir tabaka elde etmek zordur. Bir "eğik" dilim retinanın göreceli düz bir dilim almak için alternatif bir yöntem olabilir . Eğik dilim almak için, filtre kağıdı ve agar bloğu olarak Fig.2B gösterilen retina arasında başka bir filtre kağıdı koyun . Amacrine hücre soma dilim yüzeyinde bazı alanlarda mükemmel bir yatay dilim bekleyemezsiniz rağmen, her zaman vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinanın yatay dilim hazırlık birçok önemli avantajları vardır.
İlk olarak, amacrine hücreleri ve yatay hücreleri gibi, yatay dendritler genişletmek hücrelerin morfolojisi, korunur. Bu hücrelerinin morfolojisi fizyolojik özelliği ile karşılaştırmak için oldukça önemlidir, böylece 20 farklı tipte (MacNeil ve Masland, 1998), retina amacrine hücreleri üzerinde olduğu kanıtlanmıştır.
İkincisi, tüm montaj retinada, glial hücre s endfeets geniş kapsama alanı, yama pipetler erişim amacrine hücreleri engeller. Amacrine hücrelerinin soma yatay dilim, dilim yüzeye maruz kalmaktadır.
Üçüncü olarak, bu dilim yüzeyinde bulunması nedeniyle kimyasal reaktifler kolayca hedef hücreleri ve dendritler ulaşabilirsiniz. Yıkama ve wash-out kimyasalların hızlı ve kolay.
Dördüncüsü, bu tür geleneksel kalsiyum görüntüleme gibi floresan iyon görüntüleme performable. Geleneksel dikey dilimleri ya da tüm montaj retinanın görüntüleme kendisi için uyarma ışık fotoreseptörlerin harekete geçirir. Uyarma kirlenme ışık uyarılmış eserler olacak şekilde yatay dilim hazırlama, fotoreseptör ve photopigments tamamen kaldırılır. Fotoreseptörlerin arka plan aktivitesi ortadan kalkar Bunun yanı sıra, görüntüleme sinyal-gürültü oranı çok daha yüksektir. Yatay kesit hazırlanması en büyük dezavantajı, fotoreseptör ve ganglion hücreleri arasında dikey bağlantı, dilim içinde herhangi bir görsel bilgi işlem olduğunu kesilir.
Bu teknik, retinaya goldfish, fare ve tavşan (Fig.1B) gibi herhangi bir standart hayvanların uygulanabilir. Yatay dilim yöntemi, nöronlar ve retina sinir devreleri fonksiyonu soruşturmada alternatif bir yol sunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm deneysel protokolleri hayvan kullanımı için sağlık kuralları National Institutes göre yapılmıştır.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür ederim. Retinanın yatay dilim hazırlama prosedürü kurmak için bize değerli tavsiyeleri ve önerileri veren Richard H. Masland ve Akimichi Kaneko.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
