Summary
Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений.
Abstract
Традиционно вертикальная часть и целое монтажа подготовки сетчатки были использованы для изучения функции сетчатки схем. Однако многие из нейронов сетчатки, такими как amacrine клеток, расширить свои дендриты горизонтально так, что морфология клетки должна быть серьезно поврежден в вертикальных срезов. В целом монтажа подготовки, особенно для патч-зажим записей, нейронов сетчатки в среднем слое не являются легкодоступными из-за широкого освещения глиальные клетки (Мюллер ячейки) endfeets с. Здесь мы описываем новый метод нарезки сохранить дендритных морфологии нейронов сетчатки без изменений. Срез был сделан горизонтально на внутренний слой сетчатки использованием vibratome слайсер после сетчатки было заложено в низкой температурой плавления агарозном геле. В этом горизонтальные подготовки кусочек сетчатки, мы изучили функцию нейронов сетчатки по сравнению с их морфологии, с помощью патч-зажим записи, техника визуализации кальция, иммуноцитохимия, и одноклеточные RT-PCR.
Protocol
- Подготовка агара блок (30 мг / мл, то есть 3%, в дистиллированной воде). Растворите и микроволновые это первый и перелить его в стеклянную посуду. Держите блюдо в холодильнике при температуре 4 ° С.
Совет: агар блок должен быть подготовлен заранее.
- Подготовка низкой температуры плавления агарозном геле (25 мг / мл, т.е. 2,5%, в среде). Растворите и микроволновые его. Храните ее в ванну с горячей водой при температуре 35 ° С.
Совет: Имейте в агарозном геле не слишком жарко. Если она слишком горячая, она занимает много времени, чтобы быть затвердевшим, и гель может убить сетчатки
. - Усыпить животное, выяснять глазного яблока и открыть его как наглазник. Для сжижения стекловидного тела, открыл наглазник вымачивают в течение 10 мин в гиалуронидазы в среде (0,07 мг / мл), если это необходимо.
- Вырезать агар в блок (например, 1 см х 1,5 см для мыши сетчатки) и прочно прикреплены на vibratome стадии мгновенного клея. Хранить агар блок мокрой.
- Место лезвием на 5 градусов на срез. Аккуратно вырезать верхнюю поверхность агара блок со скоростью ок. 50 мкм / с, частота. 50 Гц.
Совет: Убедитесь, что верхняя поверхность агара блок абсолютно гладкой и ровной. Несколько разрезов (по крайней мере 3 раза), может быть, необходимых для получения гладкой и ровной поверхности агара блока.
- Промыть наглазник со средой без гиалуронидазы. Изолировать сетчатки от пигментного эпителия и поместить его фоторецепторов стороной вниз на лист фильтровальной бумаги. Чтобы прочно прикрепить сетчатку к фильтровальной бумаге, вакуумные сетчатки на фильтровальной бумаге несколько раз.
Совет: Убедитесь, что сетчатка прикрепляется к фильтровальной бумаге абсолютно плоской. После того как вы положили сетчатки на фильтровальной бумаге, вырезать избыточное фильтровальной бумаги окружающей сетчатки (рис. 2). Избыток фильтровальной бумаги часто мешает лезвие от вдаваясь в соответствующий слой сетчатки.
- Аккуратно протрите лишнюю среды на агар блока и осторожно поместите сетчатки на фильтровальную бумагу на агар блока. Чтобы твердо место фильтровальной бумаги на агар блока, приложите мгновенного клея на краю фильтровальной бумаги.
Совет: Чтобы избежать unexpectable трещины, места сетчатки, как перед возможной степени на верхней поверхности агара блока.
- Аккуратно влить низкой температуры плавления агарозном геле за сетчаткой. Подождите 1 мин и осторожно вылейте среды на это, чтобы охладить его. Агарозном геле становится затвердевшим быстро.
Совет: Слишком жарко агарозном гель убивает сетчатки.
- Поднимите положением лезвия до нескольких сотен мкм выше верхней поверхности агара блока и аккуратно вырезать начало затвердевших агарозном геле.
- Книзу положением лезвия. Вырезать сетчатки на уровне проксимальной трети внутренний ядерный слой (примерно между 200 и 250 мкм выше верхней поверхности агара блок).
Совет: Слишком большая скорость лезвия может повредить сетчатку строго. Приблизительный 50 мкм / сек (50 Гц) является целесообразным.
- Обратите внимание, что amacrine клетки в настоящее время лицевой стороной вниз. Тщательно подберите кусочек сетчатки вместе с затвердевшим агарозном геле и поместить его лицевой стороной вверх в камере или блюдо.
Подсказка: Поскольку мышь сетчатки является крошечным и волнистые, трудно получить идеальный горизонтальный срез на соответствующем слое. "Косой" срез может быть альтернативным методом, чтобы получить относительную плоский кусок сетчатки. Чтобы получить косой срез, поставить еще один бумажный фильтр между сетчаткой на фильтровальную бумагу и агар блока, как показано на рис.2б. Хотя вы не можете ожидать, идеальный горизонтальный срез, Есть всегда несколько областей, где сомы amacrine ячейка находится на поверхности среза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных преимуществ горизонтальной подготовки кусочек сетчатки.
Во-первых, морфология клетки, которые расширяют дендритов горизонтально, таких как amacrine клетки и горизонтальные клетки, сохраняется. Было показано, что Есть более 20 видов amacrine клеток в сетчатке (Макнил и Masland, 1998), так что это довольно важно сравнить морфологию клеток с физиологического свойства.
Во-вторых, в целом монтажа сетчатки, широкое освещение endfeets глиальных клеток с предотвращает доступ патч для пипеток amacrine клеток. В горизонтальных ломтиков, сомы из amacrine клетки подвергается поверхность ломтиками.
В-третьих, химические реактивы можно легко добраться до клеток-мишеней и их дендритов, потому что они расположены на поверхности ломтиков. Вымойте-ин и вымывания химических веществ быстро и легко.
В-четвертых, флуоресцентные изображения ионно таких как обычные изображения кальция performable. В традиционной вертикальной ломтиками или целые монтажа сетчатки, возбуждающего света для работы с изображениями сама активирует фоторецепторов. В горизонтальном подготовки ломтик, фоторецепторы и фотопигмента полностью удалена, так что нет никакого загрязнения возбуждающего света, вызывали артефактов. Кроме того, отношение сигнал-шум изображения значительно выше, так фоновой активности фоторецепторов устраняется. Самый большой недостаток горизонтальных подготовки срез, что вертикальные связи между фоторецепторы и ганглиозные клетки разрезают так, что нет никакой обработки визуальной информации в срез.
Эта техника применима к сетчатке любой стандартный животных, таких как золотые рыбки, мыши и кролика (рис.1б). Метод горизонтального среза может предложить альтернативный путь в исследовании функции нейронов и нейронных цепей в сетчатке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все экспериментальные протоколы были проведены в соответствии с Национальными Институтами Здоровья руководящие принципы для использования животных.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. Ричард Х. Masland и Акимичи Канеко за предоставленную нам ценные советы и предложения устанавливает порядок горизонтальных подготовки кусочек сетчатки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
