Summary
传统的垂直切片和视网膜的整个安装准备视网膜电路的功能已被用来研究。在这里，我们描述了新的切割方法，保存完整的视网膜神经细胞的树突状形态。
Abstract
传统的垂直切片和视网膜的整个安装准备视网膜电路的功能已被用来研究。然而，许多视网膜神经细胞，如无长突细胞，，扩大自己的树突水平，从而使细胞的形态，应该是在垂直切片受到严重损坏。在整个安装准备，尤其是对于膜片钳记录，在中间层的视网膜神经细胞由于覆盖范围广的神经胶质细胞（穆勒细胞）小号endfeets，不容易接触。在这里，我们描述了新的切割方法，保存完整的视网膜神经细胞的树突状形态。使用vibratome切片视网膜内层片水平后视网膜嵌入在低温熔化琼脂糖凝胶。视网膜水平切片准备在此，我们研究了视网膜神经细胞的功能，它们的形态相比，通过使用膜片钳记录，钙成像技术，免疫细胞化学，单细胞RT - PCR检测。
Protocol
- 准备琼脂块（30毫克/毫升，即3％，蒸馏水）。溶解和微波先倒入一个玻璃盘。在冰箱中保持在摄氏4度的菜
提示：琼脂块应提前做好准备。
- 准备低的温度熔化琼脂糖凝胶（25毫克/毫升，即2.5％，在中等）。解散，微波它。保持在35 摄氏度的热水澡
提示：保持琼脂糖凝胶不会太热。如果实在太热，它需要很长一段时间，待凝固，凝胶可以杀死视网膜
。 - 安乐死的动物，enucleate的眼球，并打开它作为一个眼罩。液化玻璃体，打开眼罩，被浸泡在介质中透明质酸酶10分钟（0.07毫克/毫升），如果一定。
- 剪切成块（例如，1厘米× 1.5厘米小鼠视网膜）的琼脂，并坚信一个vibratome舞台上瞬间胶重视。琼脂块湿。
- 放置在切片机5度的刀片。轻轻地削减的速度约在琼脂块的顶面。 50微米/秒，频率。 50赫兹。
提示：确保琼脂块的顶面是完全光滑平整 。 可能需要几个削减（至少3次），琼脂块光滑平整的表面。
- 没有透明质酸酶的培养基冲洗眼罩。视网膜色素上皮细胞从隔离，并放在滤纸感光端。要牢固地附着在视网膜的滤纸，滤纸上真空视网膜几次。
提示：确保视网膜是完全平坦的滤纸。当你把在滤纸上，视网膜周围的视网膜（图2a）削减多余的滤纸。过剩的滤纸上，往往阻碍进入适当的视网膜层刀片 。
- 琼脂块上轻轻擦拭多余的介质，并小心地在滤纸上的琼脂块上的视网膜。要牢固放置的滤纸上的琼脂块，瞬间胶附着在滤纸的边缘。
提示：为了避免unexpectable裂纹，尽可能面前的琼脂块的顶面的视网膜 。
- 轻轻地倒在视网膜的低温熔化的琼脂糖凝胶。等待1分钟，轻轻地倒在介质中冷却。琼脂糖凝胶快速凝固。
提示：太热琼脂糖凝胶杀死了视网膜。
- 电梯到数百微米以上的琼脂块的顶面和刀片位置，轻轻地削减凝固的琼脂糖凝胶顶部。
- 降低刀片的位置。削减视网膜内核层（大约在200至250微米以上的琼脂块的顶面）的近端三分之一的水平。
提示：过多的刀片的速度会严重损伤视网膜 。 约。 50微米/秒（50赫兹）是适当的。
- 请注意，无长突细胞现在朝下。小心地拿起视网膜切片一起凝固的琼脂糖凝胶和它正面朝上放置在室内或一盘菜。
提示：由于小鼠视网膜的细小波浪，它是很难获得一个完美的水平切片在适当的层 。 一个“斜”片可能是一种替代方法，以获得相对视网膜平片。要获得斜切片，放视网膜之间的另一个滤纸，在滤纸上，并在图2B所示的琼脂块 。 虽然你不能指望一个完美的水平切片，总有一些无长突细胞的SOMA片表面上的某些地方。
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Discussion
有几个重要的优点是视网膜的水平切片准备。
首先，扩大树突如无长突细胞和水平细胞水平，细胞的形态，被保存下来。它已被证明有超过20种无长突细胞在视网膜（麦克尼尔和Masland，1998年），所以它是很重要的，比较细胞的形态与生理属性。
第二，在整个安装视网膜的神经胶质细胞endfeets的广泛覆盖，防止补丁移液器无长突细胞的访问。在横向切片，无长突细胞的胞体接触片表面。
第三，化学试剂可以很容易地达到目标细胞和他们的树突，因为这些是位于片表面上。冲洗和化学清洗是快速和容易的。
第四，传统的钙成像技术，如荧光离子成像演出;。在传统的垂直切片或整个安装视网膜，影像本身的光激发，激活的光感受器。在水平切片制备，感光细胞和photopigments完全拆除，以便有没有激发光诱发文物的污染。此外，成像的信号信噪比高得多，因为背景光感受器活动被淘汰。水平切片准备的最大缺点是垂直感光细胞和神经节细胞之间的连接被切断，以便有没有视觉信息加工的片内。
这种技术适用于任何标准的动物，如金鱼，鼠标和兔子（图1b）视网膜。水平切片的方法，可以提供另一种方式，在调查的视网膜中的神经元和神经回路的功能。
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Disclosures
所有实验的协议进行，根据国家机构使用动物的健康指引。
Acknowledgments
我们感谢博士。理查德H Masland和Akimichi金子给我们宝贵的意见和建议，以建立视网膜的水平切片制备过程。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
