Summary
परंपरागत रूप से ऊर्ध्वाधर टुकड़ा और रेटिना की तैयारी पूरी माउंट रेटिना सर्किट के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम उपन्यास विधि टुकड़ा करने की क्रिया रेटिना बरकरार न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान आकारिकी की रक्षा का वर्णन.
Abstract
परंपरागत रूप से ऊर्ध्वाधर टुकड़ा और रेटिना की तैयारी पूरी माउंट रेटिना सर्किट के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, amacrine कोशिकाओं के रूप में रेटिना न्यूरॉन्स के कई उनके dendrites क्षैतिज विस्तार, ताकि कक्षों की आकारिकी ऊर्ध्वाधर स्लाइसें में बुरी तरह क्षतिग्रस्त हो माना जाता है. पूरे माउंट तैयारी में, विशेष रूप से पैच - दबाना रिकॉर्डिंग के लिए, मध्यम परत में रेटिना न्यूरॉन्स आसानी से glial सेल (म्यूएलर सेल) endfeets के व्यापक कवरेज के कारण सुलभ नहीं हैं. यहाँ, हम उपन्यास विधि टुकड़ा करने की क्रिया रेटिना बरकरार न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान आकारिकी की रक्षा का वर्णन. टुकड़ा क्षैतिज vibratome slicer का उपयोग रेटिना की भीतरी परत में बनाया गया था के बाद रेटिना कम तापमान के पिघलने agarose जेल में एम्बेडेड था. रेटिना के इस क्षैतिज टुकड़ा तैयार करने में, हम उनके आकारिकी साथ तुलना में पैच दबाना रिकॉर्डिंग, कैल्शियम इमेजिंग तकनीक, immunocytochemistry, और RT-पीसीआर एकल कक्ष का उपयोग करके रेटिना न्यूरॉन्स के समारोह का अध्ययन किया.
Protocol
- एक अगर ब्लॉक (30 मिग्रा / एमएल, यानी 3%, आसुत जल में) तैयार है. भंग और माइक्रोवेव यह पहली बार है और यह एक गिलास पकवान में डालना. 4 ओ सी पर एक रेफ्रिजरेटर में पकवान रखें
सुझाव: अगर ब्लॉक अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए.
- तैयार तापमान कम पिघलने agarose जेल (25 मिलीग्राम / एमएल, मध्यम में यानी 2.5%,). भंग और इसे माइक्रोवेव. गर्म पानी से स्नान में 35 ओ सी पर रखें
सुझाव: agarose जेल भी गर्म नहीं रखें. अगर यह बहुत गर्म है, यह एक लंबे समय के लिए जम लेता है, और जेल रेटिना को मार सकता है
. - जानवर, पता लगाना, एक नेत्रगोलक euthanize और यह एक eyecup के रूप में खुला. शीशे हास्य दव्र बनाना करने के लिए, खोला eyecup माध्यम में hyaluronidase में 10 मिनट (0.07 मिलीग्राम / एमएल) के लिए लथपथ है, अगर जरूरी है.
- एक ब्लॉक (उदा., 1 सेमी x माउस रेटिना के लिए 1.5 सेमी) में अगर कट और दृढ़ता से तुरंत गोंद द्वारा एक vibratome मंच पर संलग्न है. अगर ब्लॉक गीला रखें.
- Slicer में 5 डिग्री पर ब्लेड रखें. धीरे अगर ब्लॉक के लगभग गति से ऊपर की सतह में कटौती. 50 सुक्ष्ममापी / सेक, freq. 50 हर्ट्ज.
सुझाव: सुनिश्चित करें कि अगर ब्लॉक के शीर्ष सतह पूरी तरह से चिकनी और सपाट है. कई कटौती (कम से कम 3 बार) अगर ब्लॉक की चिकनी और सपाट सतह की जरूरत हो सकता है .
- Hyaluronidase बिना माध्यम के साथ eyecup कुल्ला. एक वर्णक उपकला से रेटिना पृथक और यह फोटोरिसेप्टर साइड फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर नीचे जगह है. मजबूती फिल्टर पेपर के लिए रेटिना देते हैं, फिल्टर पेपर पर रेटिना कई बार वैक्यूम.
सुझाव: सुनिश्चित करें कि रेटिना फिल्टर कागज पूरी तरह से फ्लैट के लिए जुड़ा हुआ है. के बाद आप फिल्टर पेपर पर एक रेटिना डाल, अतिरिक्त फिल्टर रेटिना (Fig.2A) के आसपास कागज काटा . अतिरिक्त फिल्टर पेपर अक्सर रेटिना के उचित परत में जाने से एक ब्लेड रोकता है.
- धीरे अगर खंड पर अतिरिक्त मध्यम पोंछ और ध्यान से फिल्टर पेपर पर अगर ब्लॉक पर रेटिना जगह. मजबूती अगर ब्लॉक पर फिल्टर पेपर जगह, फिल्टर पेपर के किनारे पर तुरंत गोंद देते हैं.
युक्ति: unexpectable दरार से बचने के लिए, संभव के रूप में सामने के रूप में अगर ब्लॉक के ऊपर सतह पर रेटिना जगह.
- धीरे रेटिना पर कम तापमान के पिघलने agarose जेल डालना. 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और धीरे से उस पर मध्यम डाल इसे शांत. agarose जेल जल्दी जम हो जाता है.
सुझाव: बहुत गर्म agarose जेल रेटिना को मारता है.
- अगर ब्लॉक के ऊपर की सतह से ऊपर कई सैकड़ों सुक्ष्ममापी ब्लेड स्थिति लिफ्ट और धीरे जम agarose जेल के शीर्ष में कटौती.
- नीचे ब्लेड स्थिति लोअर. प्रॉक्सिमल भीतर परमाणु परत (अगर ब्लॉक के ऊपर की सतह से ऊपर 200 और 250 के बीच सुक्ष्ममापी में लगभग) के तीसरे स्तर पर रेटिना कट.
युक्ति: ब्लेड के बहुत ज्यादा गति रेटिना गंभीर नुकसान होगा. लगभग. 50 सुक्ष्ममापी / सेक (50 हर्ट्ज) उपयुक्त है.
- सूचना है कि amacrine कोशिकाओं चेहरा नीचे अब कर रहे हैं. ध्यान से ऊपर रेटिना का टुकड़ा के साथ और जम agarose जेल के साथ लेने के एक कक्ष या एक डिश में चेहरा जगह है.
युक्ति: क्योंकि माउस रेटिना छोटे और लहराती है, यह मुश्किल है एक उचित परत पर एक सही क्षैतिज टुकड़ा प्राप्त है . एक "परोक्ष" टुकड़ा रेटिना के रिश्तेदार फ्लैट टुकड़ा पाने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है. तिरछा टुकड़ा प्राप्त करने के लिए, रेटिना के बीच में फिल्टर पेपर और अगर ब्लॉक के रूप में Fig.2B में दिखाया गया है पर एक और फिल्टर पेपर रखा. हालांकि आप एक सही क्षैतिज टुकड़ा उम्मीद नहीं कर सकते, वहाँ हमेशा कुछ क्षेत्रों में जहां amacrine सेल सोम टुकड़ा की सतह पर है .
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Discussion
रेटिना के क्षैतिज टुकड़ा तैयारी के कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं.
सबसे पहले, कोशिकाओं है कि dendrites क्षैतिज amacrine कोशिकाओं और क्षैतिज कोशिकाओं के रूप में, विस्तार की आकारिकी, संरक्षित है. यह दिखाया गया है कि रेटिना में 20 amacrine कोशिकाओं के प्रकार (मेकनेल और Masland, 1998) से अधिक हैं, इसलिए है कि यह काफी महत्वपूर्ण है शारीरिक संपत्ति के साथ कक्षों की आकारिकी की तुलना.
दूसरा, पूरी माउंट रेटिना में, glial सेल endfeets का व्यापक कवरेज amacrine कोशिकाओं को पैच pipettes के उपयोग से बचाता है. क्षैतिज स्लाइस में, amacrine कोशिकाओं के सोम स्लाइस की सतह के संपर्क में है.
तीसरा, रासायनिक अभिकर्मकों आसानी से लक्षित कोशिकाओं और उनके dendrites के लिए पहुंच कर सकते हैं, क्योंकि इन स्लाइस की सतह पर स्थित हैं. धो और धोने बाहर रसायनों के तेजी से और आसान कर रहे हैं.
चौथा, जैसे पारंपरिक कैल्शियम इमेजिंग फ्लोरोसेंट आयन इमेजिंग performable है. पारंपरिक ऊर्ध्वाधर स्लाइसें या पूरे माउंट रेटिना में ही इमेजिंग के लिए उत्तेजना प्रकाश photoreceptors सक्रिय है. क्षैतिज टुकड़ा तैयारी में, photoreceptors और photopigments पूरी तरह से इतना है कि वहाँ उत्तेजना का कोई संदूषण प्रकाश पैदा कलाकृतियों को हटा रहे हैं. इसके अलावा, इमेजिंग के संकेत से शोर अनुपात बहुत अधिक है क्योंकि photoreceptors के पृष्ठभूमि गतिविधि का सफाया कर दिया है. क्षैतिज टुकड़ा तैयारी का सबसे बड़ा नुकसान यह है कि photoreceptors और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के बीच खड़ी कनेक्शन तो कट जाता है कि टुकड़ा के भीतर कोई दृश्य सूचना संसाधन है कि.
इस तकनीक सुनहरीमछली, माउस, और खरगोश (Fig.1B) के रूप में किसी भी मानक जानवरों की रेटिना पर लागू है. क्षैतिज टुकड़ा की विधि न्यूरॉन्स और रेटिना में तंत्रिका सर्किट के समारोह की जांच में एक वैकल्पिक तरीका की पेशकश कर सकते हैं.
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Disclosures
सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पशु उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित की गई.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. रिचर्ड एच. Masland और हमारे मूल्यवान सलाह और सुझाव देने के रेटिना के क्षैतिज टुकड़ा तैयारी की प्रक्रिया स्थापित करने के लिए Akimichi Kaneko.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
