Summary
Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta.
Abstract
Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados para estudar a função dos circuitos da retina. No entanto, muitos dos neurônios da retina, tais como as células amácrinas, expandir as suas dendrites horizontalmente, de modo que a morfologia das células é suposto ser severamente danificado nas fatias verticais. Em toda a preparação de montagem, especialmente para patch-clamp gravações, os neurônios da retina na camada do meio não são facilmente acessíveis devido à extensa cobertura de células gliais endfeets (célula Mueller) s. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta. A fatia foi feito horizontalmente na camada interna da retina usando um cortador de vibratome após a retina foi incorporado na baixa temperatura de fusão agarose gel. Nessa preparação fatia horizontal da retina, estudamos a função dos neurônios da retina comparado com sua morfologia, usando patch-clamp gravação, técnica de imageamento de cálcio, imunocitoquímica, e de uma única célula RT-PCR.
Protocol
- Prepare um bloco de agar (30 mg / ml, ou seja 3%, em água destilada). Dissolver e microondas-lo primeiro e coloque em uma travessa de vidro. Mantenha o prato no frigorífico a 4 º C.
Dica: O bloco de ágar deve ser preparado com antecedência.
- Prepare baixa temperatura de fusão-agarose gel (25 mg / ml, ou seja, 2,5%, em média). Dissolver e microondas. Mantê-lo no banho de água quente a 35 o C.
Dica: Mantenha o gel agarose não muito quente. Se for muito quente, ele leva muito tempo a ser solidificado, e que o gel pode matar a retina
. - Eutanásia do animal enuclear, um globo ocular e abri-lo como uma ocular. Para liquefazer humor vítreo, a ocular aberto é embebido por 10 min em hialuronidase no meio (0,07 mg / ml), se necessariamente.
- Corte o agar em um bloco (por exemplo, 1 cm x 1,5 cm para retina mouse) e firmemente fixados em um palco vibratome por cola instantânea. Manter o bloco de ágar molhado.
- Coloque a lâmina de 5 graus na slicer. Gentilmente cortar a superfície superior do bloco de agar na velocidade de aprox. 50 mm / seg, freq. 50 Hz.
Dica: Certifique-se que a superfície superior do bloco de agar é totalmente lisa e plana. Vários cortes (pelo menos 3 vezes) pode ser necessária para obter a superfície lisa e plana do bloco de ágar.
- Lavar a ocular com o meio sem hialuronidase. Isolar a retina de um epitélio pigmentar e coloque-o fotorreceptor cabeça para baixo em um pedaço de papel de filtro. Para firmemente anexar a retina ao papel de filtro, vácuo da retina no papel de filtro várias vezes.
Dica: Certifique-se que a retina está ligado ao filtro de papel completamente plana. Depois de colocar a retina no filtro de papel, corte o excesso de papel filtro em torno da retina (Fig.2A). O excesso de papel de filtro, muitas vezes impede uma lâmina de ir para a camada apropriada da retina.
- Limpe cuidadosamente o excesso de médios no bloco de agar e coloque cuidadosamente a retina sobre o papel de filtro sobre o bloco de ágar. Para firmemente colocar o papel de filtro sobre o bloco de ágar, anexar cola instantânea na borda do papel de filtro.
Dica: Para evitar rachadura unexpectable, coloque a retina como frente possível na superfície superior do bloco de ágar.
- Delicadamente despeje a baixa temperatura de fusão do gel agarose sobre a retina. Espere por 1 min e derrame delicadamente o meio sobre ele para resfriá-lo. O gel de agarose torna-se solidificou rapidamente.
Dica: Muito quente agarose gel mata a retina.
- Levante a posição da lâmina de várias centenas M acima da superfície superior do bloco de agar e gentilmente cortar o topo da solidificou agarose gel.
- Mais abaixo da posição da lâmina. Cortar a retina ao nível do proximal de um terço da camada nuclear interna (aprox. entre 200 e 250 M acima da superfície superior do bloco de agar).
Dica: Excesso de velocidade da lâmina irá danificar a retina severamente. Aprox. 50 mm / s (50 Hz) é apropriada.
- Observe que as células amácrinas estão agora viradas para baixo. Com cuidado, pegue a fatia da retina juntamente com o gel de agarose solidificou e colocá-lo virado para cima em uma câmara ou um prato.
Dica: Como a retina do rato é pequeno e ondulado, é difícil obter uma fatia perfeita horizontal em uma camada apropriada. Uma fatia "oblíquas" pode ser um método alternativo para obter a fatia relativa plano da retina. Para obter a fatia oblíqua, colocar outro papel de filtro entre a retina sobre o papel de filtro eo bloco de ágar, conforme mostrado na Fig.2B. Embora você não pode esperar que uma fatia horizontal perfeita, há sempre algumas áreas onde soma de células amácrinas está na superfície da fatia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Existem várias vantagens importantes da preparação fatia horizontal da retina.
Primeiro, a morfologia das células que se expandem horizontalmente dendrites, como as células amácrinas e células horizontal, é preservada. Tem sido demonstrado que há mais de 20 tipos de células amácrinas na retina (MacNeil e Masland, 1998), de modo que é muito importante para comparar a morfologia das células com a propriedade fisiológica.
Em segundo lugar, em toda a retina de montagem, a extensa cobertura do endfeets células gliais s impede o acesso de pipetas patch para células amácrinas. No fatias horizontais, a soma das células amácrinas é exposta à superfície das fatias.
Terceiro, reagentes químicos pode chegar facilmente a células-alvo e as suas dendrites, porque estes estão localizados na superfície das fatias. Lave-in e lave-out de produtos químicos são rápidos e fáceis.
Quarta, a imagem de íons fluorescentes, como imagem de cálcio convencional é performable. Nos cortes tradicionais vertical ou toda a retina de montagem, luz de excitação para a imagem em si ativa fotorreceptores. Na preparação fatia horizontal, fotorreceptores e fotopigmentos são totalmente removidos para que não haja contaminação de excitação de luz evocado artefatos. Além disso, a relação sinal-ruído de imagem é muito maior porque a atividade de fundo de fotorreceptores é eliminado. A maior desvantagem da preparação fatia horizontal é que conexão vertical entre fotorreceptores e células ganglionares é cortado de modo que não há processamento de informações visuais dentro da fatia.
Esta técnica é aplicável à retina de qualquer padrão, como animais goldfish, mouse e coelho (Fig.1b). O método da fatia horizontal pode oferecer uma maneira alternativa em investigar a função dos neurônios e circuitos neurais na retina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Todos os protocolos experimentais foram conduzidos de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde diretrizes para uso animal.
Acknowledgments
Agradecemos a drs. Richard H. Masland e Akimichi Kaneko por nos dar conselhos e sugestões valiosas para estabelecer o procedimento da preparação fatia horizontal da retina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
