Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: כונן ייצור

Summary

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק מערך כונן מיקרו להקלטות אלקטרו כרונית בחולדות.

Abstract

הקלטה כרונית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים היא טכניקה ערך עבור לומד את הפונקציה של מעגלים עצביים אצל חולדות מתנהג ער. מכשירי הקלטה קל נושא מערך צפיפות גבוהה של tetrodes לאפשר ניטור סימולטני של פעילות של עשרות עד מאות נוירונים בודדים. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מערך כונן מיקרו עם 21 עצמאי מטלטלין מיקרו כוננים. מכשיר זה שימש בהצלחה להקליט נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח במעבדה שלנו. אנחנו מראים איך להכין אישית מעוצבת, 3-D בסיס פלסטיק מודפס כי תקיים מיקרו כוננים. אנו מדגימים כיצד לבנות את הפרט מיקרו כוננים כיצד להרכיב את מערך שלם כונן מיקרו. הכנה נוספת של מערך הכונן להשתלה כירורגית, כגון ייצור של tetrodes, הטעינה של tetrodes לתוך מערך את הכונן ציפוי זהב, מכוסה במאמר וידאו הבאים.

Protocol

1. Micro-כונן מערך סקירה
   
   מערך שלם מיקרו הכונן מכיל מספר מרכיבים עיקריים (איור 1):
   1. מחשב מעוצב בסיס פלסטיק המכיל 21 עצמאי מטלטלין מיקרו כוננים.
   2. צינורית בחלק התחתון של הבסיס שבו קבוצה של צינורות מדריך נייח tetrode נאסף.
   3. 21 מיקרו כוננים שכל לסחוב tetrode ואשר יכול להיות מונע בנפרד באמצעות בורג.
   4. ממשק אלקטרודה הלוח עבור הקישוריות בין tetrodes מראש מגברים.
   5. חרוט מגן (לא מוצג באיור. 1)
   6. מערך מיקרו כונן התאספו מלא, בסיס פלסטיק מחזיקה כל מיקרו כוננים. כל כונן מיקרו נושא tetrode יחיד. Tetrode מחובר חשמלית ללוח ממשק אלקטרודה בראש מערך מיקרו הכונן, ועובר דרך הצינור מדריך נייח כדי לצאת לכיוון המוח בחלק התחתון של מערך כונן המיקרו. סיבוב הבורג על כל כונן מיקרו מקדמות או חזר בו tetrode.


2. עיצוב של בסיס פלסטיק
   
   אנו מעצבים את בסיס הרכבה הכונן מיקרו בחבילה CAD 3-D תוכנה (SolidWorks). היתרון של תהליך in-house זה העיצוב הוא תחלופה מהירה וגמישות בעיצוב. במעבדה וילסון עיצבנו וריאנטים רבים של חלק זה, נועדו על דרישות ספציפיות של כל ניסוי. הקובץ 3-D מודל נשלח ללשכת שירות שבו הוא מודפס שרף לייזר לריפוי באמצעות נוזל stereolithography. זמן אספקה ​​היא קטנה כמו 2 ימים. החלק המתקבל הוא קל משקל, לשימוש חוזר, וניתן במכונה להחזיק חוט. בפרוטוקול זה נשתמש בסיס הכונן נועד עם אתר הקלטה בודדת המחזיקה 21 כוננים מיקרו. קובץ העיצוב SolidWorks נעשה זמין לפי בקשה.



3. הכנת בסיס פלסטיק
   
   בסיס פלסטיק מעובד כדי להכיל את מיקרו כוננים את הברגים לצרף את ממשק אלקטרודה הלוח ואת חרוט מגן. אין אפשרות להדפיס באופן מהימן חלקה דרך החורים בבסיס פלסטיק, כך אנו מתכננים חורים גוץ, אז להרחיב אותם על ידי קידוח. בזהירות ליישר את המקדח עם ציר החור הקיים לפני קידוח במהירות נמוכה מאוד. מקדח משתנה מהירות / מומנט יד עובד היטב עבור משימה זו.
   1. לקדוח את החורים טייס 21 עבור כונן מיקרו ברגים (הטבעת החיצונית) באמצעות קצת # 61.
   2. מקדחה 21 חורים עבור הכונן מיקרו צינוריות תמיכה (את הטבעת הפנימית) בעזרת קצת # 65.
   3. לקדוח את החורים אשר ישמשו לצרף את ממשק אלקטרודה לוח חרוט מגן באמצעות מעט 1.55 מ"מ.
   4. לחצו להתאים שרוול (5 מ"מ ארוך 20 דק Ga קיר צינורות נירוסטה) לתוך זה של הטבעת הפנימית של חורים בעזרת פינצטה או צבת כך שהוא מיושר עם בסיס פלסטיק. השרוולים להבטיח תנועה חלקה של כונן מיקרו צינורות תמיכה.
      
      בשלב הבא, כל החורים כי תקיים ברגים טפח. ב פלסטיק מודפס, חוט יוצרי תוצאה הברזים הנושאים עמיד יותר מאשר חוט חיתוך הברזים טיפוסי. סגנון זה של ברז דורש חורים טייס גדול. באמצעות מלחציים כף יד סיכה להחזיק את הברז:
   
   
   5. הקש את החורים עבור כונן מיקרו ברגים באמצעות ברז המתאים לגודל הבורג בשימוש (M1.2x0.25) וכן חומר סיכה יבש. כדי לעזור ליישר את ברז עם חור הטייס, להוסיף אורך צינורות Ga 23 לתוך השרוול לצד זה.
   6. עיצוב בסיס פלסטיק שלנו כולל מתנע ברז עבור חור מיקרו הכונן כל בורג, כדי לוודא את החוטים הראשונים אינם פגומים בתהליך השחלה. אחרי הכל הם חורים מושחל, התחלה אלה ברז יכול להיות בקלות כיבה באמצעות סכין גילוח.
   7. הקש את החורים כי תקיים את הברגים של הלוח אלקטרודה ממשק ואת חרוט מגן באמצעות ברז 1-72.


4. החדרת צינורות מדריך אלקטרודה
   
   
   1. כדי להפוך את הצינורית המכילה את כל המדריך צינורות נייחים אלקטרודה, לחתוך חתיכה 1.5cm באורך של 13 צינורות נירוסטה Ga ו לחספס את פני השטח עם גלגל השחזה Dremel כדי לשפר את הידבקות אקריליק על ידי השיניים.
   2. הכנס הזה צינורית לתוך החור בתחתית בסיס פלסטיק, לוודא כי הוא שותף ליניארי עם הציר האנכי של הכונן, ובטוחה עם אקריליק אפוקסי או שיניים. השאירו 5-7 מ"מ של צינורית חשוף כדי להקל על ניתוח ההשתלה.
   3. גזור 21 נייח מדריך אלקטרודה הצינורות (קוטר צינורות גמישים polyimide, פנימי: 0.0071 ", קוטר חיצוני: 0.0116") בסכין גילוח לאורך של 6 ס"מ.
   4. להאכיל את צינורות מדריך אחד בכל פעם לתוך השרוולים בחלק העליון של הבסיס לנהוג כל הדרך דרך צינורית האספן בתחתית. ראייה לבדוק סטיות או צינורות כיפוף מוגזם להחליף במידת הצורך. כדי להקל על הכניסה ויישור מקביל של צינורות מדריך tetrode, אפשר להתחיל עם הראשון האכלה חבילה שלמה של 21 צינורות מדריך לתוךאספן צינורית מלמטה. ואז, אחד בכל פעם, להסיר צינור מדריך מהצרור ולהאכיל אותו מהחלק העליון של בסיס פלסטיק דרך החור שהוא השאיר מאחוריו הצרור.
   5. דחוף את צינורות מדריך למטה עד שהם להאריך רק 1-2 מ"מ מהחלק העליון של בסיס פלסטיק. למרוח כמות קטנה של דבק cyanoacrylate דק צינורות כפי שהם היציאה צינורית אספן, נזהר לא לתת לאף זרם דבק לתוך סוף צינורות מדריך.
   6. השתמש סכין גילוח טרי לחתוך את עודפי צרור של צינורות מדריך בחלק התחתון של צינורית האספן.
   
   
5. ייצור של מיקרו כוננים
   
   כל כונן מיקרו מורכב בורג במכונה אישית לבין צינור חלול תמיכה (איור 2). בורג צינור תמיכה מחוברים יחד כך שפה על הבורג מוטבע אקריליק, משאיר בורג כדי לסובב בחופשיות (איור 2B). בורג הוא מושחל לתוך בסיס פלסטיק, צינור תמיכה מונע מכן מעלה או מטה כאשר הבורג מופעלת, קידום או retracting tetrode כי היא מבצעת. על מנת להקל על הסתגלות על החיה מתנהגת, ראש הבורג הוא בצורת חצי צילינדר. הפוך מברג מותאם אישית עבור הבורג הזה:
   
   1. גזור 5 ס"מ של צינורות נירוסטה 15 Ga.
   2. קח את אחד הברגים מותאמים אישית לטחון את השפתיים הבולטות.
   3. הכנס את הבורג לתוך צינורות עד החלק העליון של הבורג הוא מיושר עם סוף בצינור.
   4. לרסק את צינורות סביב הנושאים בורג שוב ושוב עם צבת נעילה כך בורג אינו יכול לסובב יחסית צינורית.
   5. השתמש מלחציים פין להחזיק מברג אישית.
      
      לפברק את מיקרו כוננים אנו משתמשים עובש 3-D פלסטיק מודפס עם בארות קטן (3 מ"מ x 5 מ"מ, 2 מ"מ עמוק). כל טוב יש שני חורים במשטח התחתון, במרווחים 2 מ"מ זו מזו, על הצינור תמיכה הבורג. לחילופין, יכול להיות מפוברק תבניות פלסטיק הנדסי כמו Delrin, באמצעות מקדחה כדי ליצור את היטב חורים.
   
   
   6. הכן את התבנית ידי ניקוי חור עבור צינורית התמיכה באמצעות מחט 23 Ga הקשה את החור עבור הבורג כפי שתואר על בסיס פלסטיק, מעל.
   7. הקו בתוך הבאר עם סיכה טפלון או שכבה דקה של וזלין, כדי לאפשר שחרור של אקריליק שיניים נרפא מן התבנית ..
   8. החל סיכה טפלון על בורג ו להכניס אותו לתוך התבנית באמצעות מברג בהתאמה אישית עד האשכולות אשר נמצאים ממש מתחת לתחתית הבאר.
   9. חיספוס מ"מ העליון של 2-3 מ"מ צינור באורך של 14 תומכים (23 Ga צינורות נירוסטה) עם גלגל שחיקה כדי לשפר הדבקה של אקריליק שיניים. הכנס אותו לתוך התבנית עד החלק העליון של הצינורית נמצא באמצע הדרך בין החלק העליון של הבאר העליון של הבורג.
   10. יוצקים אקריליק שיניים לתוך הבאר. תנועה התססה משמש כדי להבטיח כי אקריליק שיניים זורם לתוך כל החללים סביב הבורג ואת הצינורית תמיכה. הסר את כל בועות האוויר עם מחט קטנה.
   11. המתן עד אקריליק שיניים הוא נרפא לגמרי (15-30 דקות) ולאחר מכן להסיר את הכונן מיקרו מן התבנית על ידי סיבוב הבורג נגד השעון חכם.
   12. חשוב לעשות בדיקת איכות של מיקרו כוננים. בדוק את אקריליק שיניים נרפא עבור סדקים ו / או בועות אוויר, אשר נגרמות בדרך כלל על ידי אקריליק שיניים זה היה עבה מדי או רזה מדי. כמו כן, ודא את הבורג ואת הצינור תמיכה הן מקבילות זו לזו, וכי בורג מסתובב בצורה חלקה. ברגים וצינורות תמיכה של מיקרו כוננים שאינם עונים על הקריטריונים האלה ניתן סדוק ללא אקריליק שיניים ממוחזרים.
   13. חזור על שלבים 5.6 עד 5.11 עד שיש לך 21 מיקרו כוננים.


6. הרכבה הסופי של מערך מיקרו הכונן
   
   
   1. תחתון כל כונן מיקרו לבסיס כונן פלסטיק. כל שפופרת מיקרו הכונן תמיכה צריך לעבור בצורה חלקה הן בתוך השרוול שלו על הצינור מדריך נייח שלה. ודא כי צינורות מדריך לא אבזם כמו כונן מיקרו הוא מורד.
   2. עם מיקרו כוננים הוריד לגמרי, להוסיף שכבה דקה של אקריליק שיניים הפנימי של בסיס הכונן כדי לתקן את המדריך צינורות אלקטרודה במקום.
   3. שים לב, אי ספיקת להוריד את הכוננים מיקרו כל הדרך לפני הוספת אקריליק שיניים תגרום הפתילה של אקריליק כל הדרך עד השרוולים חסימה של תנועת כונן מיקרו.
   4. תווית מיקרו כוננים 1-21.
   5. סובבו את מערך הכונן הפוכים לצלם צרור של צינורות מדריך. תמונה זו ישמשו כדי למפות את המיקום של הצינור המדריך המתאים כונן מיקרו כל אחת.
   6. תרים את כל מיקרו כוננים על ידי מ"מ מספר.
   7. הכנס polyimide הצינור המוביל (0.005 ") לתוך צינור כל מדריך מהחלק התחתון של הבסיס הכונן. תנו את הצינור המוביל להאריך 1-2 מ"מ מהחלק העליון של הרשומה כונן מיקרו והוריד באופן מלא על התצלום את זהותו של כונן מיקרו המקביל.
   8. דבקהצינור המוביל אל צינור מיקרו הכונן באמצעות תמיכה של 5 דקות אפוקסי או דבק cyanoacrylate. שים לב, דבק אפוקסי או כי הוא רזה מדי יזרמו במורד צינורית התמיכה לחסום תנועה חופשית של כונן מיקרו או, גרוע יותר, לתקן את זה כדי להנחות את הצינורית. אם זה יקרה, יחידה מיוחדת מיקרו הכונן לא ניתן להשתמש.
   9. מלא נמוך כל מיקרו כוננים. חותכים את כל צינורות המוביל את הסומק בחלק התחתון של צינורית האספן באמצעות סכין גילוח טרי.
   10. לבסוף, הר הלוח Neuralynx ממשק אלקטרודה לבסס את הכונן באמצעות שני ברגים (גודל: 1-72, אורך: 3 / 16 ").

בנקודה זו את מערך הכונן הוא מוכן להיות טעון עם tetrodes. המצאה של tetrodes, איך לטעון אותם לתוך מיקרו כוננים, ואיך להכין את מערך הכונן להשתלה כירורגית הם נושאיו של המאמר וידאו הבאים.

באיור 1. דגם של מערך מיקרו כונן המוגמר. מערך מיקרו הכונן מורכב מרכיבים מרכזיים: בסיס כונן פלסטיק; צינורית אספן שממנו tetrodes להזין את המוח; 21 מיקרו כוננים שכל כונן tetrode יחיד; ממשק אלקטרודה לוח המתחבר קדם מגברים.

איור 2. Custom מיקרו כונן ברגים. רישומים א טכניים של עיצוב מותאם אישית בורג. בורג כולל חלק מושחל (M1.2x0.25; בקוטר 1.2 מ"מ, 0.25 מ"מ / בתורו)., ראש חצי צילינדר שמתאים מברג המנהג שלנו עשה וחלק חלקה עם השפה (ראו פירוט) של דגם B. כונן מיקרו להשלים. צינורית התמיכה בורג אישית מחוברים במלט שיניים. השפה על הבורג מוטבע בבטון שיניים מאפשר סיבוב חופשי בעת נהיגה הצינור תמיכה למעלה או למטה.

קבצים נוספים

אנו מעוצבים על בסיס כונן מודפס, חרוט מגן העובש לבנייה של מיקרו כוננים בתוכנה SolidWorks 2008 3D CAD:

• הורד את הקובץ: DriveBase.sldprt אשר מכיל מודלים של הבסיס הכונן חרוט כובע מגן.
• הורד את הקובץ: MicroDriveMold.sldprt המכיל מודל של עובש מיקרו הכונן

הלשכה 3D שירות ההדפסה לא יכול להתמודד עם קבצים מקומיים Solidworks ישירות, אלא דורש את קבצי העיצוב stereolithography CAD בפורמט (STL). עבור אנשים שאין להם גישה לתוכנות Solidworks, אבל עדיין רוצה להשתמש בחלקים מודפסים המשמשים במאמר וידאו נכלול את העיצובים בפורמט STL גם:

• הורד את הקובץ: DriveBase.stl אשר מכיל בסיס מודל של כונן
• הורד את הקובץ: MicroDriveMold.stl המכיל מודל של עובש מיקרו הכונן
• הורד את הקובץ: ProtectionCap.stl המכיל מודל של מכסה עבור חרוט מגן
• הורד את הקובץ: ProtectionCone.stl המכיל מודל חרוט מגן

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את המאפיינים הכלליים של תהליך מיקרו כונן את הבניין. זה כבר שונה בהצלחה לייצר כונן arrays עם מטרות הקלטה מרובות או מערכים קטנים יותר עבור הקלטות בעכברים. בנוסף להקלטה של ​​ההיפוקמפוס, חוקרים רבים להשתמש כוננים אלה למקד מבנים קורטיקליים ותת קורטיקליים. השימוש בברגים יותר עשויות להידרש על מנת להקליט מבנים מוחיים עמוקים יותר. עם שינוי נרחב לבסס את הכונן, הכוננים ממונע שלי לשמש במקום אלה באופן ידני שהפך, מה שמאפשר דיוק, התאמה tetrode מרחוק (ימאמוטו ווילסון, 2008). אישית נייח צינורית הסדרים מדריך שימשו במקום צינורית הראשי מעגלי להשיג שליטה מרחבית על חלוקת tetrodes בקליפת ו בהיפוקמפוס.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D-printed plastic parts	Material	American Precision Prototyping (www.approto.com)
stainless steel tubing	Material	Small Parts (www.smallparts.com)
Dental cement powder	Material	A-M Systems (www.a-msystems.com)	525000
Dental cement solvent	Material	A-M Systems	526000
Electrode interface board	Material	Neuralynx (www.neuralynx.com)	EIB-81
micro-drive screws	Material	Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)
’Tap-Ease’ tapping lubricant	Tool	AGS Company	TA-2
Polyimide tubing	Material	IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)
Cordless drill/driver	Tool	DeWalt (www.dewalt.com)	DC750KA
Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft	Tool	Dremel (www.dremel.com)	3956-02
Razor blades	Tool	VWR (www.vwr.com)	55411-050
Watch glass	Tool	VWR	66112-107
Tap for custom screws	Tool	Balax	01302
Taps	Tool	Small Parts	HSBT-0172, HSBT-0080
Pin vise	Tool	Vargus	3SHC1--I
Drill bits	Tool	Small Parts
Benchtop vise	Tool	Panavise	301
No.2 Dumont forceps	Tool	Stoelting (www.stoeltingco.com)	52100-27
5-minute epoxy	Tool	Allied Electronics (www.alliedelec.com)
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven (www.aveninc.com)	18768 (Pattern 304)
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)	25-1000
Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark	96F8903
mini pin vise	Tool	MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)	00920314