Summary
In questo protocollo dimostriamo come fabbricare un micro-drive array per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti.
Abstract
Registrazione cronica di grandi popolazioni di neuroni è una tecnica utile per studiare la funzione dei circuiti neuronali in ratti svegli comportarsi. Dispositivi di registrazione leggero portando una serie ad alta densità di tetrodi consentire il monitoraggio simultaneo dell'attività di decine o centinaia di singoli neuroni. Qui si descrive un protocollo per la realizzazione di un micro-drive array con 21 indipendentemente mobile micro-unità. Questo dispositivo è stato usato con successo per registrare da neuroni corticali e dell'ippocampo nel nostro laboratorio. Mostriamo come preparare un costume disegnato, 3-D di base stampata in plastica che si terrà il micro-drive. Dimostriamo come costruire le singole micro-unità e come assemblare l'intero micro-drive array. Ulteriore preparazione del array di unità per l'impianto chirurgico, come ad esempio la fabbricazione di tetrodi, carico di tetrodi in array di unità e di doratura, è coperto in un articolo il video successivo.
Protocol
- Micro-drive array panoramica
Un completo micro-drive array è costituito da diversi componenti principali (Fig. 1):- Un computer progettato base in plastica che contiene 21 indipendentemente mobili micro-unità.
- Una cannula sul fondo della base in cui sono raccolte una serie di tubi fissi guida tetrodo.
- 21 micro-unità che entrambi portatori di un tetrodo e che possono essere azionati singolarmente con una vite.
- Una scheda di interfaccia di elettrodi per l'interconnessione tra tetrodi e pre-amplificatori.
- Un cono di protezione (non mostrato in Fig. 1).
- In una completamente assemblato micro-drive array, la base in plastica contiene tutte le micro-unità. Ogni micro-drive porta un tetrodo singolo. Il tetrodo è elettricamente collegato alla scheda di interfaccia elettrodo nella parte superiore del micro-drive array, e passa attraverso il tubo di guida stazionario per uscire verso il cervello nella parte inferiore del micro-drive array. Ruotando la vite su ogni micro-drive avanza o si ritrae il tetrodo.
- Progettazione di base in plastica
Progettiamo la base di montaggio del micro-drive in un 3-D pacchetto di software CAD (SolidWorks). Il vantaggio di questo in-house processo di progettazione è rapido turnover e la flessibilità del design. Nel laboratorio di Wilson abbiamo progettato molte varianti di questa parte, orientata verso le esigenze specifiche di ogni esperimento. Il 3-D di file modello viene inviato a un ufficio di servizio dove è stampato da un laser-curabile resina liquida tramite stereolitografia. Il tempo di consegna è di soli 2 giorni. La parte che ne risulta è leggero, riutilizzabile e può essere lavorato per tenere un filo. In questo protocollo useremo una base di unità che è stato progettato con un sito di registrazione singolo e che contiene 21 micro-unità. Il file di progettazione SolidWorks è reso disponibile su richiesta. - Preparazione di base in plastica
La base in plastica è trasformato per ospitare il micro-drive e le viti per fissare la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione. Non è possibile stampare affidabile liscia attraverso i fori nella base di plastica, in modo da progettare fori sottodimensionate, quindi espandere loro da foratura. Allineare con cura la punta con l'asse del foro esistente prima di forare a velocità molto bassa. Una variabile di velocità / coppia trapano a mano funziona bene per questo compito.- Praticare i fori di 21 per la micro-drive viti (l'anello esterno) con un po '# 61.
- Praticare i 21 fori per il micro-drive tubi di supporto (l'anello interno) con un po '# 65.
- Praticare i fori che verranno utilizzati per collegare la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione con un po '1,55 mm.
- Stampa montare un manicotto (5 mm di lunghezza 20 Ga parete sottile tubo di acciaio inox) in ogni dell'anello interno di fori con un paio di pinzette o un paio di pinze in modo che sia a filo con la base in plastica. Le maniche assicurare la facilità del micro-drive tubi di sostegno.
Successivamente, tutti i fori che conterrà le viti sono sotto controllo. In plastica stampata, fili che formano risultato rubinetti in più thread durevoli rispetto tipica filettatura rubinetti. Questo stile di rubinetto richiede fori più grandi. Usando un portatile morsa pin per tenere il rubinetto: - Toccare i fori per il micro-drive viti utilizzando un rubinetto che corrisponde alla dimensione della vite in uso (M1.2x0.25) e un lubrificante secco. Per allineare il rubinetto con il foro pilota, inserire una lunghezza di 23 tubi Ga nel manicotto accanto ad essa.
- Il nostro progetto base in plastica è dotato di un antipasto rubinetto per ogni micro-drive foro della vite per assicurarsi che i fili iniziali non vengano danneggiati durante il processo di threading. Dopo che tutti i fori sono filettati, questi antipasti rubinetto può essere facilmente spense con una lama di rasoio.
- Toccare i fori che conterrà le viti per la scheda di interfaccia elettrodo e il cono di protezione con un 1-72 rubinetto.
- Inserimento di tubi guida elettrodo
- Per rendere la cannula che contiene tutti i fissi tubi guida elettrodo, tagliare un pezzo di 1,5 centimetri di lunghezza di 13 tubi di acciaio inox e Ga irruvidire la superficie con una ruota Dremel rettifica per migliorare l'adesione dal acrilico dentale.
- Inserire questo cannula nel foro sul fondo della base di plastica, verificare che sia co-lineare con l'asse verticale del disco, e fissarlo con acrilico dentale o epossidica. Lasciare 5 a 7 mm della cannula esposti per facilitare l'impianto chirurgico.
- Tagliare 21 stazionarie tubi guida elettrodi (tubi flessibili in poliammide, diametro interno: 0,0071 ", diametro esterno: 0,0116") con una lama di rasoio per una lunghezza di 6 cm.
- Alimentare i tubi di guida, uno alla volta nelle maniche al vertice della base dell'unità e tutto il percorso attraverso la cannula collettore in basso. Controllare visivamente per pieghe o eccessiva curvatura tubi e sostituirli se necessario. Per facilitare l'inserimento e l'allineamento parallelo di tubi guida del tetrodo, si può iniziare con il primo che alimentano il pacco intero di 21 tubi guida fino alcannula collettore dal basso. Poi, uno alla volta, rimuovere un tubo di guida dal fascio e dei mangimi che dalla parte superiore della base in plastica attraverso il foro che ha lasciato alle spalle nel bundle.
- Spingere il tubo guida fino a quando si estendono solo 1-2 mm dalla parte superiore della base di plastica. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato sottile ai tubi che fuoriescono dalla cannula collettore, facendo attenzione a non lasciare che il flusso di colla fino alla fine dei tubi guida.
- Utilizzare una lama nuova rasoio per tagliare l'eccesso dal fascio di tubi guida alla base della cannula collettore.
- Fabbricazione di micro-unità
Ogni micro-drive è composto da una custom-lavorati a vite e un tubo di supporto vuoto (Fig. 2). La vite e il tubo di supporto sono legati insieme in modo tale che un labbro sulla vite è incorporato in acrilico, lasciando la vite di ruotare liberamente (Fig. 2B). La vite viene infilato nella base di plastica, e il tubo di supporto è poi spinto verso l'alto o verso il basso quando la vite è acceso, avanzando o ritraendo il tetrodo che essa porta. Per la facilità di regolazione del comportamento animale, la testa della vite è a forma di mezzo cilindro. Fare un cacciavite personalizzato per questo vite:- Tagliare 5 cm di 15 tubi di acciaio inox Ga.
- Prendete una delle viti personalizzati e macinare fuori dal labbro sporgente.
- Inserire la vite nel tubo fino alla cima della vite è a filo con l'estremità del tubo.
- Schiacciare il tubo intorno al filettature ripetutamente con un paio di pinze di bloccaggio in modo che la vite non può ruotare rispetto alla cannula.
- Utilizzare una morsa perno per tenere il driver personalizzato vite.
Per fabbricare il micro-drive usiamo un 3-D stampo stampato in plastica con piccoli pozzi (3 mm x 5 mm, 2 mm di profondità). Ognuno ha ben due fori nella superficie inferiore, distanziate 2 millimetri a parte, per il tubo di supporto e la vite. In alternativa, gli stampi possono essere realizzati da un tecnopolimero come Delrin, usando un trapano a colonna per creare il bene e buchi. - Preparare lo stampo eliminando il foro per la cannula di supporto utilizzando un ago di 23 Ga e toccando il foro per la vite come descritto per la base in plastica, di cui sopra.
- Linea all'interno del pozzo con lubrificante teflon o un sottile strato di vaselina per consentire il rilascio di acrilico dentale curato dallo stampo ..
- Applicare lubrificante teflon per una vite e inserirla nello stampo con il cacciavite su misura fino i fili sono appena sotto il fondo del pozzo.
- Irruvidire la parte superiore di 2-3 mm di una 14 mm di lunghezza tubo di supporto (23 Ga tubi di acciaio inossidabile), con una mola per migliorare l'adesione della acrilico dentale. Inserirla nello stampo fino alla cima della cannula è a metà strada tra la parte superiore del pozzo e la parte superiore della vite.
- Versare acrilico dentale nel pozzo. Movimento agitazione è utilizzato per garantire che l'acrilico dentale scorre in tutti gli spazi intorno alla vite e tubo di sostegno. Eliminare eventuali bolle d'aria con un piccolo ago.
- Attendere che la acrilico dentale è completamente guarito (15-30 minuti) e quindi rimuovere il micro-drive dallo stampo girando la vite antiorario.
- E 'importante fare un controllo di qualità del micro-unità. Ispezionare la acrilico curato dentale per crepe e / o bolle d'aria, che di solito sono causate da acrilico dentali che era troppo spessa o troppo sottile. Inoltre, assicurarsi che la vite e il tubo di supporto sono paralleli tra loro e che la vite gira senza problemi. Viti e tubi di sostegno delle micro-unità che non soddisfano questi criteri possono essere craccate gratuitamente dal acrilico dentale e riciclati.
- Ripetere i passaggi attraverso 5,6 5,11 fino ad avere 21 micro-unità.
- L'assemblaggio finale di micro-array di unità
- Inferiore di ogni micro-drive nella base disco di plastica. Ogni micro-drive tubo di supporto dovrebbe muoversi senza problemi sia all'interno della manica e sul suo tubo di guida stazionaria. Verificare che i tubi guida non deformarne il micro-drive viene abbassato.
- Con il micro-drive completamente abbassato, aggiungere un sottile strato di acrilico dentale verso l'interno della base del disco per fissare i tubi guida elettrodo in posizione.
- Si noti che il mancato abbassare i dischi micro tutta la strada prima di aggiungere l'acrilico dentale si tradurrà in wicking della acrilico tutta la strada le maniche e ostruzione di micro-drive movimento.
- Etichettare il micro-drive 1-21.
- Girare l'array di unità a testa in giù e scatta una foto del fascio di tubi guida. Questo quadro sarà utilizzato per mappare la posizione del tubo di guida corrispondente a ciascun micro-drive.
- Alzare tutte le micro-drive da alcuni mm.
- Inserire un poliimmide tubo portante (0.005 ") in ciascun tubo di guida dalla parte inferiore della base dell'unità. Lasciate che il tubo portante estendere 1-2 mm dalla parte superiore del disco completamente abbassata micro-drive e sulla fotografia e l'identità del corrispondente micro-drive.
- Incollare ilvettore tubo al tubo di micro-drive supporta l'utilizzo di 5 minuti o colla epossidica cianoacrilato. Si noti che la colla epossidica o troppo sottile scorrerà lungo la cannula sostegno e ostacolare il movimento libero del micro-unità o, peggio, fissare alla cannula guida. Se questo accade, quel particolare micro-drive unità non può essere utilizzato.
- Abbassare completamente tutti i micro-unità. Tagliare tutti i tubi di supporto via filo alla base della cannula collettore utilizzando una lama di rasoio fresca.
- Infine, montare la Neuralynx scheda di interfaccia elettrodo a base di guidare con due viti (dimensioni: 1-72, lunghezza: 3 / 16 ").
A questo punto l'array di unità è pronto per essere caricato con tetrodi. Fabbricazione di tetrodi, come caricarli nel micro-unità, e come preparare l'array di unità per l'impianto chirurgico sono oggetto di un articolo il video successivo.
Figura 1. Modello di finito micro-drive array. Un micro-drive array è costituito da diversi componenti principali: una base di plastica drive; una cannula collezionista da cui il tetrodi entrare nel cervello, 21 micro-unità che ogni unità di un singolo tetrodo; una scheda di interfaccia elettrodo che si connette alla pre-amplificatori.
Figura 2. Personalizzati micro-drive viti. A. disegni tecnici di progettazione della vite personalizzata. La vite presenta una parte filettata (M1.2x0.25; 1,2 mm di diametro, 0,25 mm / giro)., Una mezza testata che corrisponda al nostro driver personalizzato vite fatte e una parte liscia con le labbra (vedi dettaglio) Modello B. completa di micro-unità. Il tubo di supporto e la vite personalizzati sono collegati con del cemento dentale. Il labbro sulla vite è incorporato nel cemento dentale e consente la rotazione libera durante la guida del tubo di supporto su o giù.
File aggiuntivi
Abbiamo progettato la base disco stampato, il cono di protezione e lo stampo per la costruzione del micro-drive in SolidWorks 2008 software CAD 3D:
- Scarica il file: DriveBase.sldprt che contiene i modelli della base dell'unità e cono protettivo e cappello.
- Scarica il file: MicroDriveMold.sldprt che contiene il modello del micro-drive stampo
Il servizio di stampa 3D ufficio non può gestire file nativi di SolidWorks direttamente, ma richiede piuttosto il file di progetto in formato CAD stereolitografia (STL). Per le persone che non hanno accesso al software Solidworks, ma ancora desidera utilizzare le parti stampate usata nell'articolo video che includono disegni in formato STL anche:
- Scarica il file: DriveBase.stl che contiene il modello di base di guidare
- Scarica il file: MicroDriveMold.stl che contiene il modello di micro-drive stampo
- Scarica il file: ProtectionCap.stl che contiene il modello di cap per cono protettivo
- Scarica il file: ProtectionCone.stl che contiene il modello di cono protettivo
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Discussion
Questo protocollo descrive le caratteristiche generali del micro-drive processo di costruzione. E 'stato modificato con successo per la produzione di array di unità di registrazione con obiettivi più o meno gli array per le registrazioni nei topi. Oltre a registrare dalla ippocampo, molti ricercatori utilizzano queste unità per indirizzare le strutture corticali e sub-corticali. L'uso di viti più lunghe può essere richiesto al fine di registrare da strutture cerebrali profonde. Con una sostanziale modifica alla base dell'unità, unità motorizzate mio essere usato al posto di quelli manualmente torniti, consentendo una maggiore precisione, regolazione a distanza tetrodo (Yamamoto e Wilson, 2008). Personalizzati stazionario accordi cannula guida sono state utilizzate al posto della cannula circolare principale per raggiungere il controllo sulla distribuzione spaziale del tetrodi nella corteccia e nell'ippocampo.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Linus D. Sun e Jeenah Jung, che ha avuto origine l'uso del computer progettato, 3-D unità stampato nel nostro laboratorio per la registrazione da topi. Inoltre, vorremmo ringraziare tutti i membri passati e presenti Lab Wilson per il loro contributo a micro-drive e la tecnologia di sviluppo tetrodo in laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
