Summary
In dit protocol hebben we laten zien hoe een micro-drive array voor chronisch elektrofysiologische opnames bij ratten fabriceren.
Abstract
Chronische opname van grote populaties van neuronen is een waardevolle techniek voor het bestuderen van de functie van de neuronale circuits in wakkere gedragen ratten. Lichtgewicht opname-apparatuur die een hoge dichtheid scala aan tetrodes zorgen voor de gelijktijdige bewaking van de activiteiten van tientallen tot honderden individuele neuronen. Hier beschrijven we een protocol voor de fabricage van een micro-drive array met eenentwintig onafhankelijk beweegbare micro-drives. Dit apparaat is met succes gebruikt voor het opnemen van de hippocampus en corticale neuronen in ons lab. We laten zien hoe je een op maat ontworpen, 3-D bedrukt plastic basis die houdt van de micro-drives voor te bereiden. We laten zien hoe de individuele micro-drives te bouwen en hoe de volledige micro-drive-array monteren. Verdere voorbereiding van de drive-array voor chirurgische implantatie, zoals de fabricage van tetrodes, het laden van tetrodes in de drive-array en gold-plating, is bedekt met een volgend video-artikel.
Protocol
- Micro-drive-array overzicht
Een complete micro-drive array bestaat uit een aantal hoofdcomponenten (afb. 1):- Een computer is ontworpen plastic basis die 21 onafhankelijk van elkaar beweegbare micro-drives houdt.
- Een canule aan de onderkant van de basis, waarin een reeks van stationaire Tetrode geleidebuizen is verzameld.
- 21 micro-drives die dragen beide een Tetrode en die kunnen afzonderlijk worden aangestuurd met behulp van een schroef.
- Een elektrode interfacekaart voor de interconnectie tussen tetrodes en pre-versterkers.
- Een beschermende kegel (niet afgebeeld in figuur 1.)
- In een volledig geassembleerd micro-drive array, de plastic basis bevat alle micro-stations. Elk micro-aandrijving draagt een Tetrode. De Tetrode is elektrisch verbonden met de elektrode-interface bord op de top van de micro-drive array, en loopt door de stilstaande gids buis om naar de hersenen af te sluiten aan de onderkant van de micro-drive array. Door de schroef op elke micro-drive voorschotten of trekt de Tetrode.
- Ontwerp van kunststof voet
Wij ontwerpen de basis van de micro-drive montage in een 3-D CAD-software pakket (SolidWorks). Het voordeel van deze in-house ontwerp-proces is een snelle omzet en de flexibiliteit van het ontwerp. In het lab Wilson we hebben ontworpen vele varianten van dit deel, gericht op de specifieke eisen van elk experiment. De 3-D model bestand wordt verzonden naar een servicebureau waar het wordt afgedrukt van een laser-drogende vloeibare hars met behulp van stereolithografie. Doorlooptijd is zo weinig als 2 dagen. De resulterende deel is lichtgewicht, herbruikbaar, en kan worden bewerkt tot een draad vast te houden. In dit protocol zullen we gebruik maken van een station basis die is ontworpen met een enkele opname locatie en welke 21 micro-drives houdt. De SolidWorks ontwerp bestand is beschikbaar op aanvraag. - Voorbereiding van de kunststof voet
De kunststof bodem is verwerkt om de micro-drives en de schroeven geschikt voor de elektrode-interface van commissarissen en de beschermende kegel bevestigen. Het is niet mogelijk om een betrouwbare glad door gaten af te drukken in de kunststof basis, dus we ontwerpen ondermaatse gaten, vouw ze door het boren. Lijn de boor met de as van het bestaande gat voor boren bij zeer lage snelheid. Een variabele snelheid / koppel handboor werkt goed voor deze taak.- Boor de 21 gaatjes voor de micro-drive schroeven (de buitenste ring) met behulp van een # 61 bit.
- Boor de gaten voor de 21 de micro-drive ondersteuning van buizen (de binnenste ring) met behulp van een # 65 bit.
- Boor de gaten, dat zal worden gebruikt om de elektrode-interface raad van bestuur en beschermende kegel met behulp van een 1,55 mm boor te bevestigen.
- Perspassing een huls (5 mm lang 20 Ga dunne wand van roestvrij stalen buizen) in elk van de binnenste ring van gaten met behulp van een pincet of een tang zodat deze gelijk met de plastic basis. De mouwen zorgen voor een soepele beweging van de micro-drive support buizen.
Vervolgens worden alle gaten zal houden dat de schroeven getapt. In gedrukte plastics, thread-roltappen leiden tot een meer duurzame onderwerpen dan de typische thread-tappen. Deze stijl van leidingwater vereist een grotere piloot gaten. Met behulp van een hand-held pin Vise aan de kraan te houden: - Tik op de gaten voor de micro-drive schroeven met behulp van een kraan die de schroefmaat wordt gebruikt (M1.2x0.25) en een droog smeermiddel wedstrijden. Om u te helpen de kraan af te stemmen met de piloot gat, plaatst u een lengte van 23 Ga slang in de mouw ernaast.
- Onze plastic basis ontwerp is voorzien van een kraan starter voor elk micro-drive schroefgat om er zeker van de eerste vragen die niet beschadigd zijn tijdens het threading proces. Nadat alle gaten schroefdraad, kunnen deze tap starters gemakkelijk worden geklikt uitschakelen met een scheermesje.
- Tik op de gaten die de schroeven zal houden voor de elektrode-interface van commissarissen en de beschermende kegel met behulp van een 1-72 kraan.
- Inbrengen van de elektrode geleidebuizen
- Om de canule dat alle stilstaande elektrode geleidebuizen houdt, snijd een 1,5 cm-lang stuk van 13 Ga roestvrij stalen buis en opruwen van het oppervlak met een dremel slijpschijf om de hechting te verbeteren door de tandheelkundige acryl.
- Plaats dit canule in het gat aan de onderkant van de plastic basis, controleert u of deze is co-lineair met de verticale as van het station, en zet het met tandheelkundige acryl of epoxy. Laat 5 tot 7 mm van de canule blootgesteld aan chirurgische implantatie te vergemakkelijken.
- Snij 21 stationaire elektrode geleidebuizen (flexibele polyimide buis, binnendiameter: 0.0071 ", buitendiameter: 0.0116") met een scheermesje tot een lengte van 6 cm.
- Voer de geleidebuizen een voor een in de mouwen aan de bovenkant van de drive basis en helemaal door de collector canule aan de onderkant. Een visuele controle op knikken of overmatig buigen en vervang tubes indien nodig. Ter vergemakkelijking van het inbrengen en parallelle uitlijning van de Tetrode geleidebuizen, kan men beginnen met de eerste het voeden van de hele bundel van 21 geleidebuizen tot in decollector canule van onderen. Dan een voor een, verwijderen van een gids tube van de bundel en diervoeders uit de bovenkant van de plastic basis door het gat dat hij achter in de bundel.
- Duw de geleidebuizen totdat ze uit te breiden slechts 1-2 mm vanaf de bovenkant van de plastic basis. Breng een kleine hoeveelheid dunne cyanoacrylaat lijm op de buizen als het verlaten van de collector canule, zorg dat u geen lijm te laten stromen tot in het einde van de geleidebuizen.
- Gebruik een nieuw scheermesje af te snijden het overtollige uit de bundel van geleidebuizen aan de onderkant van de collector canule.
- Fabricatie van micro-drives
Elk micro-aandrijving bestaat uit een op maat gefreesd schroef en een holle buis ondersteuning (afb. 2). De schroef en de ondersteuning buis samen zodanig dat een lip op de schroef is ingebed in acryl bevestigd, waardoor de schroef vrij kan draaien (Fig. 2B). De schroef is schroefdraad in de kunststof basis, en de steun buis wordt dan gereden omhoog of omlaag wanneer de schroef wordt gedraaid, het bevorderen van of het intrekken van de Tetrode die het draagt. Voor het gemak van aanpassing op de gedragen dier, de kop van de schroef is in de vorm van een halve cilinder. Maak een aangepaste schroevendraaier voor deze schroef:- Snijd 5 cm van 15 Ga roestvrij stalen buis.
- Neem een van de aangepaste schroeven en grind uit de uitstekende lip.
- Steek de schroef in de slang tot aan de bovenkant van de schroef gelijk ligt met het uiteinde van de slang.
- Crush de slang rond de schroefdraden herhaaldelijk met een paar van griptang, zodat de schroef niet kan draaien ten opzichte van de canule.
- Gebruik een pin bankschroef naar de aangepaste schroevendraaier vast te houden.
Fabriceren om de micro-drives hebben we een 3-D bedrukte plastic mal te gebruiken met kleine putten (3 mm x 5 mm, 2 mm diep). Elke kamer heeft ook twee gaten in de onderkant, 2 mm afstand van elkaar, voor de steun buis en de schroef. Als alternatief kan mallen worden vervaardigd uit een technische kunststof als Delrin, met behulp van een boor te drukken om de put en gaten te maken. - Bereid de schimmel door het opruimen van het gat voor de ondersteuning met behulp van een canule 23 Ga naald en tikken op het gat voor de schroef zoals beschreven voor de kunststof basis, hierboven.
- Bekleed de binnenkant van het goed met teflon smeermiddel of een dunne film van vaseline, zodat voor het vrijgeven van de uitgeharde tandheelkundige acryl uit de mal ..
- Van toepassing zijn teflon smeermiddel om een schroef en plaats deze in de mal met behulp van de op maat gemaakte schroevendraaier totdat de draden net onder de bodem van de put.
- Ruw de top van 2-3 mm een 14 mm lange buis te ondersteunen (23 Ga roestvrij stalen buis) met een slijpschijf om de hechting van de tandheelkundige acryl te verbeteren. Steek deze in de mal tot aan de bovenkant van de canule is halverwege tussen de bovenkant van de put en de bovenkant van de schroef.
- Giet tandheelkundige acryl in de put. Roeren beweging wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de tandheelkundige acryl stroomt in alle ruimtes rondom de schroef en de ondersteuning buis. Verwijder eventuele luchtbelletjes met een kleine naald.
- Wacht tot de tandheelkundige acryl volledig is uitgehard (15-30 minuten) en vervolgens de micro-drive te verwijderen uit de mal door de schroef tegen de klok in.
- Het is belangrijk om te doen een kwaliteitscontrole van de micro-drives. Inspecteer de uitgeharde tandheelkundige acryl op barsten en / of luchtbellen, die meestal worden veroorzaakt door tandheelkundige acryl dat was te dik of te dun. Zorg er ook voor de schroef en de steun buis zijn parallel aan elkaar en dat de schroef draait soepel. Schroeven en ondersteuning buizen van micro-drives die niet voldoen aan deze criteria kunnen worden gekraakt vrij te zijn van de tandheelkundige acryl en gerecycleerd.
- Herhaal stap 5.6 tot 5.11 tot u 21 micro-drives.
- Assemblage van micro-drive-array
- Lagere elk micro-schijf in de plastic-station basis. Elk micro-drive ondersteuning buis moeten soepel bewegen, zowel binnen haar mouw en over de stationaire geleidebuis. Controleer of dat de gids buizen niet gesp als de micro-drive wordt verlaagd.
- Met de micro-drives helemaal onderaan, voeg een dun laagje van tandheelkundige acryl aan de binnenkant van het station basis om de elektrode geleidebuizen vast te stellen plaats.
- Merk op dat het niet om de micro-drives onderste al de weg voor het toevoegen van de tandheelkundige acryl zal resulteren in wicking van de acryl helemaal tot de mouwen en obstructie van micro-drive beweging.
- Label de micro-drives 1-21.
- Schakel de drive-array op zijn kop en maak een foto van de bundel van geleidebuizen. Deze foto zal gebruikt worden om de locatie van de geleidebuis voor elke micro-drive kaart.
- Te verhogen alle micro-drives door meerdere mm.
- Plaats een polyimide drager buis (0.005 ") in elke gids buis vanaf de onderkant van de drive basis. Laat de drager buis 1-2 mm te verlengen vanaf de bovenkant van de volledig neergelaten micro-drive en en opnemen op de foto de identiteit van de bijbehorende micro-drive.
- Lijm decarrier buis om de micro-drive support buis met behulp van 5-minuten epoxy of cyanoacrylaat lijm. Merk op dat lijm of epoxy dat te dun is zal naar beneden stromen de ondersteuning canule en belemmeren vrije beweging van de micro-drive of, erger nog, vast te maken aan de gids canule. Als dit gebeurt, kan dat bepaalde micro-drive unit niet worden gebruikt.
- Volledig lagere alle micro-stations. Snijd alle de vervoerder buizen af vlak aan de onderkant van de collector canule met een vers scheermesje.
- Breng tot slot de Neuralynx elektrode interfacekaart om het station te voet met twee schroeven (size: 1-72, lengte: 3 / 16 ").
Op dit punt de drive-array is klaar om te worden geladen met tetrodes. Fabricage van tetrodes, hoe ze te laden in de micro-drives, en hoe u de drive-array voor te bereiden op chirurgische implantatie zijn de onderwerpen van een volgende video-artikel.
Figuur 1. Model van afgewerkte micro-drive array. Een micro-drive array bestaat uit een aantal grote onderdelen: een plastic schijf basis, een collector canule waarvan de tetrodes in de hersenen, 21 micro-stations die elk station een Tetrode, een elektrode interfacekaart die verbinding maakt met pre-versterkers.
Figuur 2. Custom micro-drive schroeven. A. Technische tekeningen van het aangepaste ontwerp van schroef. De schroef is voorzien van een schroefdraad deel (M1.2x0.25; 1,2 mm diameter, 0,25 mm / beurt)., Een half-cilinderkop die onze maat schroevendraaier en een glad gedeelte met lip (zie detail) wedstrijden B. Model van compleet micro-drive. De steunbuis en aangepaste schroef verbonden zijn met tandheelkundige cement. De lip op de schroef is ingebed in de tandheelkundige cement en zorgt voor vrije rotatie tijdens het rijden de steun buis omhoog of omlaag.
Extra bestanden
We ontwierpen de gedrukte aandrijving basis, de beschermende kegel en de mal voor de bouw van de micro-drives in SolidWorks 2008 3D CAD software:
- Download het bestand: DriveBase.sldprt welke modellen van de drive basis en beschermende kegel en dop bevat.
- Download het bestand: MicroDriveMold.sldprt het model van de micro-drive mal bevat
De 3D printing service bureau kan niet direct verwerken oorspronkelijke Solidworks-bestanden, maar vereist het ontwerp bestanden in stereolithografie CAD formaat (STL). Voor mensen die geen toegang hebben tot Solidworks software, maar toch wil de gedrukte onderdelen die in de video artikel gebruiken we de ontwerpen in STL-formaat ook:
- Download het bestand: DriveBase.stl het model van de aandrijving basis bevat
- Download het bestand: MicroDriveMold.stl het model van de micro-drive mal bevat
- Download het bestand: ProtectionCap.stl het model van de kap voor beschermende kegel bevat
- Download het bestand: ProtectionCone.stl het model van de beschermende kegel bevat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de algemene kenmerken van de micro-drive bouwproces. Het is met succes aangepast om te rijden arrays met meerdere opname doelen of kleinere arrays voor opnames in muizen te produceren. Naast het opnemen van de hippocampus, een groot aantal onderzoekers gebruik van deze stations te corticale en sub-corticale structuren doel. Het gebruik van langere schroeven nodig zijn om op te nemen van diepere hersenstructuren. Met de ingrijpende wijziging van de drive basis, gemotoriseerde aandrijvingen mogen niet worden gebruikt in plaats van handmatig aangezet degenen, waardoor meer precies te zijn, op afstand Tetrode aanpassing (Yamamoto en Wilson, 2008). Op maat gemaakte vaste gids canule afspraken zijn gebruikt in plaats van de circulaire belangrijkste canule aan ruimtelijke controle over de distributie van tetrodes in de cortex en de hippocampus te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Linus D. zon en Jeenah Jung, die uit het gebruik van de computer ontworpen, 3-D gedrukt stations in ons lab voor het opnemen van muizen te erkennen. Daarnaast zouden we graag alle vroegere en huidige Wilson Lab-leden bedanken voor hun bijdragen aan micro-drive en Tetrode technologie-ontwikkeling in het lab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
