Summary
En este protocolo, se muestra cómo fabricar una serie de micro-disco de crónica registros electrofisiológicos en las ratas.
Abstract
Grabación crónica de grandes poblaciones de neuronas es una técnica valiosa para el estudio de la función de los circuitos neuronales en ratas comportándose despierto. Dispositivos ligeros de grabación que lleva un conjunto de alta densidad de tetrodos permitir el control simultáneo de la actividad de decenas a cientos de neuronas individuales. Aquí se describe un protocolo para la fabricación de un arsenal de la micro-drive con veintiún independiente móviles micro-unidades. Este dispositivo ha sido utilizado con éxito para grabar desde las neuronas del hipocampo y la corteza de nuestro laboratorio. Se muestra cómo preparar un diseño personalizado, en 3-D base de plástico impreso que contendrá los discos micro-. Demostramos cómo construir las micro-unidades y la forma de montar el total de micro-array de unidades. Una mayor preparación de la unidad matriz de implante quirúrgico, como la fabricación de tetrodos, la carga de tetrodos en la matriz unidad y oro chapado, es analizada en un artículo posterior de vídeo.
Protocol
- Micro-array de unidades visión
Un total de micro-array de unidades consta de varios componentes principales (Fig. 1):- Una computadora diseñada la base de plástico que contiene 21 móviles independientemente de micro-unidades.
- Una cánula en la parte inferior de la base en que se recoge un conjunto de tubos fijos tetrodo guía.
- 21 micro-unidades que cada uno lleva un tetrodo y que pueden ser accionados individualmente mediante un tornillo.
- Una tarjeta de interfaz de electrodos para la interconexión entre tetrodos y preamplificadores.
- Un cono de protección (no se muestra en la Fig. 1.)
- En una totalmente montado micro-array de unidades, la base de plástico tiene todos los discos micro-. Cada unidad de micro-lleva un tetrodo sola. El tetrodo está conectado eléctricamente a la tarjeta de interfaz de electrodos en la parte superior de la matriz de micro-drive, y pasa por el tubo de guía fija para salir hacia el cerebro en la parte inferior de la matriz de micro-drive. Al girar el tornillo en los avances de cada unidad de micro-o se retrae el tetrodo.
- Diseño de base de plástico
Diseñamos la base de montaje de la unidad de micro-en un paquete de software 3-D CAD (SolidWorks). La ventaja de este proceso de diseño de la casa es la rápida rotación y la flexibilidad de diseño. En el laboratorio de Wilson se ha diseñado muchas variantes de esta parte, orientada a las demandas específicas de cada experimento. El archivo del modelo 3-D se envía a una oficina de servicios en los que se imprime desde una resina líquida láser curables con la estereolitografía. Tiempo de respuesta es de tan sólo 2 días. La pieza resultante es ligero, reutilizable y se puede mecanizar para mantener un hilo. En este protocolo se utilizará una base de unidad que está diseñada con un sitio de registro único y que tiene 21 micro-unidades. El archivo de diseño de SolidWorks está disponible bajo petición. - Preparación de la base de plástico
La base de plástico se procesa para dar cabida a las unidades micro-y los tornillos para sujetar la tarjeta de interfaz electrodo y el cono de protección. No es posible imprimir de forma fiable sin problemas a través de agujeros en la base de plástico, por lo que el diseño agujeros de tamaño insuficiente, a continuación, expanda ellos por la perforación. Alinee cuidadosamente la broca con el eje del agujero existente antes de perforar a muy baja velocidad. Una variable de velocidad / par taladro de mano que funciona bien para esta tarea.- Frese los orificios 21 para los tornillos de la unidad de micro-(el anillo exterior) con una broca # 61.
- Perforación de 21 agujeros de los tubos de soporte de la unidad de micro-(anillo interior) con una broca # 65.
- Taladrar los agujeros que se utiliza para conectar la tarjeta de interfaz electrodo y el cono de protección con un poco mm 1,55.
- Prensa instalar un manguito (5 mm de largo calibre 20 delgada pared de la tubería de acero inoxidable) en cada uno de los anillo interior de los agujeros con un par de pinzas o un par de alicates para que quede al ras con la base de plástico. Las mangas de asegurar un movimiento suave de los tubos de soporte de la unidad de micro-.
A continuación, todos los agujeros de los tornillos que se llevará a cabo están intervenidos. En plásticos impresos, hilo de formación de los grifos en consecuencia más duradera que las discusiones típicas de fileteado grifos. Este estilo de toque requiere grandes orificios. Utilizando una prensa de tornillo pasador de mano para mantener el grifo: - Rosca de los agujeros para tornillos de la unidad de micro-utilizando una llave que coincide con el tamaño de los tornillos utilizados (M1.2x0.25) y un lubricante seco. Para ayudar a alinear el grifo con el orificio piloto, inserte una longitud de tubería de 23 Ga en la manga de su lado.
- Nuestro diseño de base de plástico cuenta con un motor de arranque del grifo por cada agujero del tornillo micro-coche para asegurarse de que las discusiones iniciales no se dañen durante el proceso de roscado. Después de todos los agujeros son de rosca, los titulares del grifo puede ser fácilmente se desprendió una hoja de afeitar.
- Rosca de los agujeros que colocar los tornillos de la placa de interfaz electrodo y el cono de protección mediante un grifo 1-72.
- Inserción de tubos de guía de electrodos
- Para que la cánula que contiene todos los tubos guía de electrodos fijos, corte un pedazo 1,5 cm de largo, de 13 tubos de acero inoxidable y Ga raspar la superficie con una rueda de moler dremel para mejorar la adhesión por el acrílico dental.
- Insertar esta cánula en el orificio en la parte inferior de la base de plástico, comprobar que está co-lineal con el eje vertical de la unidad, y seguro que con acrílico dental o epoxi. Deja 5 a 7 mm de la cánula expuestos para facilitar la implantación quirúrgica.
- Reducción del 21 tubos de guía de electrodos fijos (flexible de poliamida diámetro de la tubería, interior: 0,0071 ", diámetro exterior: 0,0116") con una navaja a una longitud de 6 cm.
- Alimentar a los tubos guía de uno en uno en las mangas en la parte superior de la base de la unidad y todo el camino a través de la cánula de colector en la parte inferior. Visual para detectar exceso de pliegues o curvar los tubos y reemplazar si es necesario. Para facilitar la inserción y la alineación en paralelo de los tubos guía de tetrodo, se puede comenzar con la primera alimentación de todo el paquete de 21 tubos de guía para arriba en elcolector de la cánula de abajo. Luego, uno a la vez, eliminar un tubo de guía del paquete y lo alimentan de la parte superior de la base de plástico a través del agujero que dejó en el paquete.
- Empuje los tubos de guía hasta que se extienden sólo 2.1 mm de la parte superior de la base de plástico. Aplique una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato a los tubos delgados que salen del colector de la cánula, teniendo cuidado de no dejar que el flujo de cola para arriba en el extremo de los tubos guía.
- Utilice una hoja de afeitar nueva para cortar el exceso de haz de tubos guía en la parte inferior del colector de la cánula.
- Fabricación de micro-unidades
Cada unidad de micro-consiste en un tornillo de costumbre-a máquina y un tubo hueco de apoyo (Fig. 2). El tornillo y el tubo de soporte están unidos juntos de tal manera que el labio en el tornillo se inserta en acrílico, dejando el tornillo gire libremente (Fig. 2B). El tornillo se enrosca en la base de plástico y el tubo de apoyo es entonces impulsado hacia arriba o hacia abajo cuando el tornillo se gira, adelantar o retraer el tetrodo que vende. Para facilitar el ajuste en el comportamiento de los animales, la cabeza del tornillo está en la forma de medio cilindro. Hacer un destornillador a medida para este tornillo:- Cortar 5 cm, de 15 tubos de acero inoxidable, Ga.
- Tome uno de los tornillos de la costumbre y rutina en el filo que sobresale.
- Inserte el tornillo en el tubo hasta la parte superior del tornillo quede al ras con el extremo de la tubería.
- Aplastar el tubo alrededor de la rosca del tornillo en varias ocasiones con un par de alicates de bloqueo para que el tornillo no se puede girar con respecto a la cánula.
- Use un tornillo pasador para mantener el destornillador personalizado.
Para la fabricación de las unidades micro-usamos una 3-D del molde plástico impreso con los pozos pequeños (3 mm x 5 mm, 2 mm de profundidad). Cada pozo tiene dos agujeros en la superficie inferior, una separación de 2 mm, para el tubo de soporte y el tornillo. Por otra parte, los moldes se pueden fabricar a partir de un plástico de ingeniería como el Delrin, utilizando un taladro para crear el bien y agujeros. - Prepare el molde en la limpieza del agujero de la cánula admite el uso de una aguja de 23 Ga y aprovechar el agujero para el tornillo como se describe en la base de plástico, más arriba.
- Recubren el interior del pozo con el lubricante de teflón o una fina capa de vaselina para permitir la liberación del acrílico dental curado del molde ..
- Aplicar lubricante de teflón para un tornillo y la inserta en el molde con el destornillador por encargo hasta que las roscas están justo por debajo del fondo del pozo.
- Raspe la parte superior de 2-3 mm de un tubo de soporte de 14 mm de largo (23 Ga tubos de acero inoxidable), con una muela para mejorar la adhesión del acrílico dental. Insertarlo en el molde hasta la parte superior de la cánula está a medio camino entre la parte superior del pozo y la parte superior del tornillo.
- Vierta acrílico dental en el pozo. Movimiento de agitación se utiliza para asegurar que el acrílico dental fluye en todos los espacios alrededor del tornillo y el tubo de apoyo. Eliminar las burbujas de aire con una pequeña aguja.
- Espere hasta que el acrílico dental es completamente curado (15-30 minutos) y luego extraiga la unidad de micro-del molde girando el tornillo de la lucha contra el reloj.
- Es importante hacer un control de calidad de las unidades de micro-. Inspeccione el acrílico dental para curar grietas y / o burbujas de aire, que generalmente son causadas por el acrílico dental que era demasiado grueso o demasiado fino. Además, asegúrese de que el tornillo y el tubo de soporte son paralelas entre sí y que el tornillo gira suavemente. Tornillos y tubos de soporte de micro-unidades que no cumplen estos criterios puede ser violada libre de acrílico dental y reciclado.
- Repita los pasos 5.6 a través de 5,11 hasta que tienen 21 micro-unidades.
- El montaje final de la micro-array de unidades
- Menor cada unidad de micro-en la base de la unidad de plástico. Cada tubo de apoyo a la micro-disco debe moverse suavemente dentro de la manga y lo largo de su tubo de guía fija. Asegúrese de que los tubos de guía no se doblen como la unidad de micro-está bajando.
- Con las unidades de micro-totalmente bajada, agregue una capa delgada de acrílico dental al interior de la base de la unidad para fijar los tubos de guía de electrodos en su lugar.
- Tenga en cuenta que si no se baja los discos micro hasta el final antes de agregar el acrílico dental como resultado de la absorción de acrílico todo el camino hasta las mangas y la obstrucción del movimiento de micro-drive.
- La etiqueta de la micro-unidades 1-21.
- A su vez el array de unidades hacia abajo y tomar una foto del haz de tubos guía. Esta imagen se utiliza para asignar la ubicación del tubo de guía correspondiente a cada unidad de micro-.
- Levantar todas las unidades de micro-por varios mm.
- Insertar un tubo portador de poliamida (0.005 ") en cada tubo guía de la parte inferior de la base. Deje que el tubo portador extender 1-2 mm de la parte superior del registro completamente bajada micro-drive y en la fotografía y la identidad de la correspondientes micro-drive.
- Pegue eltubo portador en el tubo de apoyo a la micro-unidad con 5 minutos en epoxi o pegamento de cianoacrilato. Tenga en cuenta que el pegamento epoxi o que es demasiado delgada se bajan de la cánula de apoyo y obstruir el libre movimiento de la unidad de micro-o, peor aún, su fijación a la cánula guía. Si esto sucede, que particularmente la micro-unidad de accionamiento no se puede utilizar.
- Baje completamente todas las unidades de micro-. Cortar todos los tubos de soporte a ras en la parte inferior del colector de la cánula con una cuchilla de afeitar nueva.
- Finalmente, montar la placa de electrodos interfaz Neuralynx a la base de la unidad con dos tornillos (tamaño: 1-72, longitud: 3 / 16 ").
En este punto, la matriz unidad está lista para ser cargada con tetrodos. Fabricación de tetrodos, la forma de carga en las unidades micro-, y la forma de preparar el array de unidades para la implantación quirúrgica son objeto de un artículo de vídeo posteriores.
Figura 1. Modelo de acabado micro-array de unidades. Un array de unidades de micro-consta de varios componentes principales: una base de unidad de plástico, una cánula de coleccionista de la que el tetrodos entrar en el cerebro, 21 micro-unidades que cada unidad de un tetrodo único; una tarjeta de interfaz que se conecta a electrodos pre-amplificadores.
Figura 2. Personalizado micro-drive tornillos. Dibujos A. Técnica del diseño de tornillo a medida. El tornillo tiene una parte roscada (M1.2x0.25, 1,2 mm de diámetro, 0,25 mm / vuelta)., Una cabeza de medio cilindro que coincide con nuestra costumbre conductor hizo tornillo y una parte suave con los labios (ver detalle) Modelo B. completa micro-drive. El tubo de soporte y el tornillo de encargo están conectados con cemento dental. El labio en el tornillo está incrustado en el cemento dental y permite la rotación libre mientras se conduce el tubo de apoyo hacia arriba o hacia abajo.
Archivos adicionales
Hemos diseñado la base de la unidad impresa, el cono de protección y el molde para la construcción de las unidades micro en el software de SolidWorks 2008 de CAD en 3D:
- Descargue el archivo: DriveBase.sldprt que contiene los modelos de la base de la unidad y el cono de protección y la tapa.
- Descargue el archivo: MicroDriveMold.sldprt que contiene el modelo del molde micro-drive
La oficina de servicios de impresión en 3D no puede manejar archivos nativos de SolidWorks directamente, sino que requiere de los archivos de diseño en formato CAD estereolitografía (STL). Para las personas que no tienen acceso al software de SolidWorks, pero todavía desea utilizar las partes impresos utilizados en el artículo de video que incluyen los diseños en formato STL, así:
- Descargue el archivo: DriveBase.stl que contiene el modelo de la base de la unidad
- Descargue el archivo: MicroDriveMold.stl que contiene el modelo de molde micro-drive
- Descargue el archivo: ProtectionCap.stl que contiene el modelo de la tapa de cono de protección
- Descargue el archivo: ProtectionCone.stl que contiene el modelo de cono de protección
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Discussion
Este protocolo describe las características generales del proceso de construcción de micro-drive. Se ha modificado con éxito para producir los arrays de unidades con las metas de grabación de múltiples matrices o menor para las grabaciones en los ratones. Además de la grabación del hipocampo, muchos investigadores utilizan estas unidades al objetivo de las estructuras corticales y subcorticales. El uso de tornillos más largos puede ser necesario a fin de registrar a partir de las estructuras cerebrales más profundas. Con una amplia modificación de la base de la unidad, las unidades motorizadas de mi ser usado en lugar de los de forma manual-se volvió, lo que permite mayor precisión, el ajuste tetrodo remoto (Yamamoto y Wilson, 2008). Personalizado arreglos fijos cánula guía se han utilizado en lugar de la cánula circular principales para lograr el control espacial sobre la distribución de los tetrodos en la corteza y el hipocampo.
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Acknowledgments
Queremos agradecer a D. Lino Sol y Jung Jeenah, que se originó el uso de equipo de diseño en 3-D unidades impresas en nuestro laboratorio para la grabación de los ratones. Además, nos gustaría agradecer a todos los miembros de Wilson pasado y el presente de laboratorio, por sus contribuciones a la micro-drive y el desarrollo de la tecnología tetrodo en el laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
