Summary
I detta protokoll visar vi hur du kan tillverka en mikro-drive array för kronisk elektrofysiologiska inspelningar hos råttor.
Abstract
Kronisk inspelning av stora populationer av nervceller är en värdefull metod för att studera funktionen hos neuronala kretsar i vaken beter sig råttor. Lätt inspelningsenheter bär en hög densitet rad tetrodes möjliggöra samtidig övervakning av verksamheten på tiotals till hundratals enskilda nervceller. Här beskriver vi ett protokoll för tillverkning av en mikro-enhet array med tjugo oberoende av varandra fast mikro-enheter. Denna enhet har använts framgångsrikt för att spela in från hippocampus och kortikala neuroner i våra labb. Vi visar hur man förbereder en specialdesignad, 3-D tryckt plast bas som kommer att hålla mikro-enheter. Vi visar hur man konstruerar den enskilda mikro-enheter och hur man monterar kompletta micro-drive array. Fortsatta beredningen av enheten arrayen för kirurgiska implantat, såsom tillverkning av tetrodes, lastning av tetrodes i enheten matris och förgyllning, är täckt i en efterföljande video-artikel.
Protocol
- Micro-drive array översikt
En komplett micro-drive samling består av flera huvudkomponenter (Fig. 1):- En dator som är konstruerad plastbas som rymmer 21 självständigt lösa mikro-enheter.
- En kanyl i botten av basen där en uppsättning av stationära rör tetrode guide samlas in.
- 21 mikro-enheter som var och en bär ett tetrode och som kan enskild regi med hjälp av en skruv.
- En elektrod gränssnittskort för samtrafik mellan tetrodes och pre-förstärkare.
- En skyddande kon (visas inte i bild. 1)
- I en färdigmonterad micro-drive array, håller plastbas alla mikro-enheter. Varje mikro-drive bär en enda tetrode. Den tetrode är elektriskt ansluten till elektroden gränssnittskortet på toppen av mikro-drive array, och passerar genom den stationära styrröret till avfarten mot hjärnan på botten av mikro-drive array. Vrida skruven på varje mikro-enhet förskott eller drar tillbaka tetrode.
- Design av plastbas
Vi designar basen av mikro-drivaggregatet i en 3-D CAD-mjukvara (SolidWorks). Fördelen med detta in-house design process är snabb omsättning och flexibiliteten i designen. I Wilson labbet har vi designat många varianter av denna del inriktade på specifika krav för varje experiment. 3-D-modellen filen skickas till en servicebyrå där det skrivs ut från en laser-härdande flytande harts med stereolithography. Handläggningstid är så lite som 2 dagar. Den resulterande delen är lätt, återanvändbara och kan bearbetas för att hålla en tråd. I detta protokoll kommer vi att använda en enhet bas som är utformad med en enda inspelning platsen och som rymmer 21 mikro-enheter. SolidWorks designen filen görs tillgänglig på begäran. - Beredning av plastbas
Plasten basen behandlas för att tillgodose mikro-enheter och skruvar för att fästa styrelsen elektroden gränssnittet och den skyddande konen. Det är inte möjligt att på ett tillförlitligt Print Smooth genom hål i plasten bas, så vi designar underdimensionerade hål expandera dem genom borrning. Rikta borret med axeln av befintliga hålet före sådd vid mycket låg hastighet. En variabel hastighet / moment handborr fungerar bra för denna uppgift.- Borra 21 styrhål för mikro-drive skruvar (den yttre ringen) med en # 61 lite.
- Borra 21 hål för mikro-drive stödben (den inre ringen) med en # 65 lite.
- Borra hålen som kommer att användas för att fästa styrelsen elektroden gränssnittet och värmeskölden med en 1,55 mm borr.
- Tryck passa en hylsa (5 mm långt 20 Ga tunn vägg rostfria rör) i vart och den inre ringen av hål med hjälp av en pincett eller en tång så att den är jäms med plastbas. Ärmarna säkerställa en smidig rörelse mikro-enheten stödben.
Därefter är alla hål som kommer att hålla skruvar utnyttjas. I tryckt plast, gängformande kranar resultera i mer varaktiga trådar än typiska gängskärning kranar. Denna typ av tryck kräver större styrhålen. Med hjälp av en handhållen stifts vise att hålla kranen: - Peka på hålen för mikro-enheten skruvarna med en kran som matchar skruvstorlek används (M1.2x0.25) och ett torrt smörjmedel. För att hjälpa anpassa kranen med piloten hålet, sätt in en längd av 23 Ga slang in i ärmen bredvid.
- Vår plastbas design en kran förrätt för varje mikro-enhet skruvhålet för att se de första gängorna inte är skadade vid gängning processen. När alla hål är gängade, kan dessa peka förrätter vara enkla att bryta av med ett rakblad.
- Tryck på hål som kommer att hålla skruvarna för elektroden gränssnittskortet och värmeskölden med en 1-72 kran.
- Insättning av rör elektrod guide
- För att göra kanyl som innehåller alla de stationära rör elektroden guide, skära en 1,5 cm lång bit av 13 Ga rostfria stålrör och Rugga upp ytan med en Dremel slipskiva för att förbättra vidhäftningen av dentala akryl.
- Sätt detta kanyl i hålet i botten av plast basen, kontrollera att den är co-linjär med den vertikala axeln på enheten och fäst det med dentala akryl eller epoxi. Lämna 5 till 7 mm på kanyl som utsätts för att underlätta kirurgisk implantation.
- Skär 21 stationära rör elektroden guide (flexibel polyimid slangar, inner diameter: 0,0071 ", ytterdiameter: 0,0116") med ett rakblad till en längd på 6 cm.
- Mata guiden rören ett i taget i ärmarna på toppen av enheten bas och hela vägen genom solfångaren kanylen i botten. Kontrollera visuellt för veck eller böja och byt rör vid behov. För att underlätta införandet och parallellt anpassningen av tetrode guiden rör, kan man börja med första mata hela bunt av 21 vägleda rören upp isamlare kanyl underifrån. Sedan, en i taget, ta bort en styrröret från paketet och mata den från toppen av plast basen genom hålet att det kvar i bunten.
- Skjut guiden rören tills de sträcker sig endast 1-2 mm från toppen av plast basen. Applicera en liten mängd tunn cyanoakrylat lim för att rören när de kommer ut samlaren kanyl, var noga med att inte låta någon lim flöda upp i slutet av guiden rören.
- Använd ett nytt rakblad för att skära av överskottet från den bunt av guiden rör på botten av solfångaren kanylen.
- Tillverkning av mikro-enheter
Varje mikro-enhet består av en specialdesignad maskinbearbetade skruv och en ihålig bärröret (Fig. 2). Skruven och bärröret är fästa ihop så att en läpp på skruven är inbäddad i akryl, lämnar skruven att rotera fritt (Fig. 2B). Skruven är gängad i plasten bas, och det stöd röret är sedan drivas upp eller ner när skruven vrids framåt eller dra tillbaka tetrode som den utför. För att underlätta anpassningen på den beter sig djuret, är chef för skruven i form av en halv cylinder. Gör en egen skruvmejsel för skruv:- Klipp 5 cm 15 Ga rostfria stålrör.
- Ta en av de anpassade skruvarna och slipa bort utstickande läppen.
- Sätt i skruven i slangen tills toppen av skruven jäms med änden av slangen.
- Krossa slangen runt skruven trådar upprepade gånger med ett par låsning tång så att skruven inte kan rotera i förhållande till kanylen.
- Använd en nål skruvstäd för att hålla den anpassade skruvmejsel.
Att tillverka mikro-enheter använder vi en 3-D tryckt plastform med små brunnar (3 mm x 5 mm, 2 mm djup). Alla har väl två hål i botten ytan, placerade 2 mm från varandra, för det stöd röret och skruven. Alternativt kan mögel vara tillverkat av en teknisk plast som Delrin, med hjälp av en borr tryck för att skapa bra och hål. - Förbered formen genom att rensa hålet för det stöd kanylen med hjälp av en 23 Ga nål och knacka hålet för skruven som beskrivits för plast-basen, ovan.
- Klär insidan av brunnen med Teflon smörjmedel eller en tunn film av vaselin för att möjliggöra utsläpp av den härdade dentala akryl ur formen ..
- Applicera teflon smörjmedel på en skruv och för in den i formen med hjälp av specialtillverkade skruvmejsel tills gängorna är strax under botten av brunnen.
- Rugga upp 2-3 mm på en 14 mm lång stödröret (23 Ga rostfria rör) med en slipskiva för att förbättra vidhäftningen av dentala akryl. Sätt in den i formen tills den övre delen av kanylen är halvvägs mellan toppen av väl och toppen av skruven.
- Häll dentala akryl i brunnen. Agitera rörelse används för att säkerställa att de dentala akryl rinner ut alla utrymmen runt skruven och stöd röret. Ta bort eventuella luftbubblor med en liten nål.
- Vänta tills dentala akryl är helt botad (15-30 minuter) och sedan ta bort mikro-enheten från mögel genom att vrida skruven counter-klocka klokt.
- Det är viktigt att göra en kvalitetskontroll av mikro-enheter. Inspektera botade dentala akryl för sprickor och / eller luftbubblor, som oftast orsakas av dentala akryl som var för tjockt eller för tunt. Se också till att skruven och stödröret är parallella med varandra och att skruven blir smidigt. Skruvar och rör stöd till mikro-enheter som inte uppfyller dessa kriterier kan knäckas fri från det dentala akryl och återvinnas.
- Upprepa steg 5,6 till 5,11 tills du har 21 mikro-enheter.
- Slutmonteringen av mikro-drive array
- Lägre varje mikro-enheten i plast-enheten basen. Varje mikro-drive stödröret bör röra sig smidigt både inom sin ärm och över dess stationära styrrör. Kontrollera att att den handledning som rören inte spänne som mikro-enheten sänks.
- Med mikro-enheter helt sänkt, lägg ett tunt lager av dentala akryl till insidan av enheten bas för att fixa rören elektroden guiden på plats.
- Observera att underlåtenhet att sänka mikro kör hela vägen innan du lägger det dentala akryl kommer att resultera i fuktspridande av akryl hela vägen upp ärmarna och obstruktion av mikro-drive rörelse.
- Märk mikro-enheterna 1-21.
- Vrid enheten rad upp och ner och ta en bild av den bunt av guiden rör. Denna bild kommer att användas för att kartlägga var de styrröret motsvarar varje mikro-enhet.
- Höj alla mikro-enheter av flera mm.
- Sätt in en polyimid bärare rör (0,005 ") i varje styrröret från botten av enheten basen. Låt den transportör röret sträcker sig 1-2 mm från toppen av helt sänkt mikro-enheten och och spela på fotografiet identitet Motsvarande mikro-enhet.
- Limmabärare röret till mikro-drive stödröret med 5-minuters epoxy eller cyanoakrylat lim. Observera att lim eller epoxi som är för tunt kommer rinna ner det stöd kanylen och hindrar fri rörelse av mikro-enheten eller, ännu värre, fixa det till guiden kanylen. Om detta händer, kan just mikro-drivenheten inte användas.
- Sänk alla mikro-enheter. Skär alla transportören rören från spola längst ner på solfångaren kanyl med en fräsch rakblad.
- Slutligen montera Neuralynx styrelsen elektroden gränssnitt till enheten basen med två skruvar (storlek: 1-72, längd: 3 / 16 ").
Vid denna punkt enheten arrayen är redo att laddas med tetrodes. Tillverkning av tetrodes, hur du fyller på dem i mikro-enheter och hur man förbereder enheten arrayen för kirurgisk implantation är ämnen för en efterföljande video artikel.
Figur 1. Modell av färdiga micro-drive array. En micro-drive samling består av flera huvudkomponenter: en plast-enhet bas, en samlare kanyl från vilken tetrodes in i hjärnan, 21 mikro-enheter som varje enhet en enda tetrode, en elektrod gränssnittskort som ansluter till redan förstärkare.
Figur 2. Custom mikro-enheten skruvar. A. Tekniska ritningar av den anpassade skruv design. Skruven har en gängad del (M1.2x0.25, 1,2 mm diameter, 0,25 mm / varv)., En halv-topplock som matchar våra kundanpassade skruvmejsel och en smidig del med läpp (se detalj) B. Mall för kompletta mikro-enhet. Stödröret och anpassade skruvar är anslutna med dentala cement. Läppen på skruven är inbäddad i det dentala cement och tillåter fri rotation under körning stödröret uppåt eller nedåt.
Ytterligare filer
Vi designade den tryckta driva basen, den skyddande kon och formen för byggandet av mikro-enheter i SolidWorks 2008 3D CAD-program:
- Ladda ner filen: DriveBase.sldprt som innehåller modeller av enheten bas och skyddande kon och lock.
- Ladda ner filen: MicroDriveMold.sldprt som innehåller modell av mikro-drive mögel
3D-utskrifter servicebyrå kan inte hantera infödda SolidWorks-filer direkt, utan kräver utformningen filer i stereolithography CAD-format (STL). För människor som inte har tillgång till SolidWorks, men ändå skulle vilja använda den tryckta delar som används i videon artikeln vi inkluderar de mönster i STL-format också:
- Ladda ner filen: DriveBase.stl som innehåller modell av enheten bas
- Ladda ner filen: MicroDriveMold.stl som innehåller modell av mikro-drive mögel
- Ladda ner filen: ProtectionCap.stl som innehåller modellen av tak för värmeskölden
- Ladda ner filen: ProtectionCone.stl som innehåller modell av värmeskölden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver de allmänna dragen i mikro-enheten byggprocessen. Det har varit framgångsrikt modifierats för att producera köra matriser med flera inspelning mål eller mindre matriser för inspelningar i möss. Förutom att spela in från hippocampus, många forskare använder dessa enheter för att rikta kortikala och subkortikala strukturer. Användningen av längre skruvar kan krävas för att spela in från djupare hjärnstrukturer. Med omfattande modifiering av enheten bas, kör motordrivna min användas i stället för manuellt vände dem, vilket gör att mer exakt, fjärr tetrode justering (Yamamoto och Wilson, 2008). Skräddarsydda stationära guide kanyl arrangemang har använts i stället för den cirkulära viktigaste kanylen för att uppnå fysisk kontroll över distributionen av tetrodes i cortex och hippocampus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka för Linus D. Sun och Jeenah Jung, som har sitt ursprung användning av dator som är konstruerad-, 3-D tryckt enheter i vårt labb för inspelning från möss. Dessutom skulle vi vilja tacka alla tidigare och nuvarande Wilson Lab medlemmar för deras bidrag till mikro-enhet och tetrode teknikutveckling i labbet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
