Summary
Исследование сложного поведения в опорно-двигательного
Abstract
Мухи обеспечивают важной моделью для изучения сложного поведения из-за множества генетических инструментов, доступных для исследователей в этой области. Изучение опорно-двигательного поведения в
Protocol
Часть 1: Питание и управление мух
- Мухи должны быть выращены в бутылки, содержащие дрожжи без стандартных средствах массовой информации. Вам понадобится большое количество мух, так кресты должны быть установлены соответствующие подходы. Мухи должны быть выращены в 12-часовой световой: темно цикла при 25 º C.
- Мухи должны быть собраны вскоре после eclosion (1-3 дней). Мухи могут быть разработаны на этой стадии использованием диффузора углекислый газ, и должны быть отсортированы в пробирки, содержащие в автоклаве или дрожжей, свободных средств массовой информации. Мы используем только для мужчин, хранится от 10 до пробирке.
- Позвольте по крайней мере день или два после использования диоксида углерода до запуска поведенческих экспериментов. Бежим летит в наши поведенческие анализ 3-5 дней после ECLOSION.
- Анализы всегда должно быть сделано в течение 2-3 час же временное окно каждый день, чтобы избежать вопросов циркадный ритм.
Часть 2: Настройка системы слежения в контролируемой среде
- Все эксперименты проводятся в комнатных условиях, который поддерживает постоянную температуру 25 ° С с 70% влажности.
- Приостановить цифровую видеокамеру над областью для записи (камера направлена вниз). Так как наша программа отслеживания отличие основе, мы приостанавливаем камеры на световой короб. Камера записывает видео непосредственно на Dell компьютеру через FireWire соединение. Мы используем Sharp цифровую видеокамеру, подключить к компьютеру Dell с Windows MovieMaker (Vista-версия) для видео приобретения.
- Воздух импульсов будет управляться в этот протокол, так что источник потока воздуха должны присутствовать в комнате. Использование резиновой трубки, подключить источник воздуха на угольный фильтр для фильтрации воздуха.
- Использование более резиновой трубки, подключите другой стороне угольный фильтр колбу через полую резиновую пробку и заполните колбу около половины дюйма воды. Это будет увлажнять воздух.
- Колба также должны иметь пистолет, который будет подключаться к Y-образный клапан с помощью резиновой трубки.
- Одна ветвь Y-клапан должен быть подключен к расходомера. Другая ветвь должна подавать воздух на площадь камеры передвижения.
Часть 3: Обеспечение летит к передвижению камеры
- Квадратная камера передвижения основана на дизайне от волка и соавт. 2002 1, с добавлением небольшого лотки, чтобы предотвратить падение мух от летящих в камере. Камера должна быть разобрана, а все компоненты должны быть тщательно протирать с 70% этанола и сушат перед использованием.
- Анестезия сразу до проведения поведенческого анализа может привести к нарушению работы. Чтобы избежать этого, мухи осторожно постучал в камеру помощью воронки с небольшим розетки. Для того, чтобы выход нужного размера, придают синие кончика пипетки (для P1000) до конца воронки. Используйте ножницы, чтобы отрезать самом конце наконечником пипетки, чтобы сделать открытие, достаточно большой для лететь, чтобы пройти.
- Начало нашей камере небольшой кусок оргстекла помощи винтов по краям. Когда винты удаляются, дыры могут быть использованы для доставки мух в камере. Позиция оргстекло верхней так, чтобы отверстие для винта сидит прямо над внутренней камере, а не от того, где винт обычно сидит. Возьмите пробирку с мухами и поместите его вверх ногами над воронкой, которая должна быть помещена в отверстие для винта.
- Не перемещайте воронку, так как это может повредить или повреждения мух. Вместо этого, мягко взрыва все камеры, воронку и все, пока все мухи внутри камеры. Этот стук должно быть сделано на коврик для мыши, чтобы поглотить шок этого стучать. Когда мухи внутри, удалите воронку, и вновь позицию топ плексигласа над винтом кровати. Затем снова винт плексигласа топ на место.
Часть 4: Запуск опорно-двигательного Пробирной
- Как только мухи загружена правильно, пусть они акклиматизироваться в камере в течение 30 минут. Этот период акклиматизации должна состояться в контролируемых условиях (25 º С, влажности 70%), а камеры должны быть размещены в верхней части светового короба (который должен быть включен). Включите другие огни комнаты прочь.
- После акклиматизации период, переключатель Y-клапан в системе воздушного потока так, что воздух будет только поток расходомера. Включите воздух, и рампы воздуха до желаемой скорости (4,0-6,0 л / мин). Мы обычно используют 5,0-5,5 л / мин, но любой скорости в этом диапазоне будет работать.
- Как только желаемый воздушной скорости достигается, переключатель Y-клапан так, чтобы воздушные потоки для передвижения камеры. Время этого воздушного импульса в течение 15 секунд, а затем резко повернуть воздуха выключен. При повороте с воздуха, включите камеру в режим записи. (Эта часть нужна практика, чтобы сделать все сразу).
- Остановить запись после нужное время и SAVE. Мы записываем 30 секунд испытания с частотой 10 кадров в секунду (по крайней мере 8 исследований в генотипе).
Часть 5: Анализ Видео
- Мы используемДинамическая система анализа изображения (ДИАС) программного обеспечения 3.2 для отслеживания движения 2. Для того, чтобы использовать это программное обеспечение, мы сначала преобразовать наше видео формата AVI с Quicktime 7.5.5.
- Для отслеживания мухи на основе контраста, мы используем "Autotrace на пороге" функции. Затем мы используем "Make Путь от следа", чтобы оцифровать эти следы.
- Для вывода мгновенной скорости каждого летать, мы используем "Вычислить параметры", чтобы производить файл базы данных (DIAS специфику). Используя эту функцию, мы также гладкие данные с помощью "5,15,60,15,5" Тьюки Сглаживание Window.
- Как только эта информация выдается в виде файла базы данных, он может быть открыт в Microsoft Excel. Мы используем сценарий Matlab для компиляции мгновенной скорости движения в Excel и вычислять дополнительные параметры, необходимые для понимания динамики движения и боя структуры.
Представитель Результаты:
На рисунке 1 показана представитель следы от организмы дикого типа Кантон S (рис. 1, слева) и мух нуль для dCASK ген, были получены путем скрещивания двух крупных перекрывающихся делеций (Df (3R) x307 и Df (3R) x313) (рис. 1 , правая панель). мух dCASK нулевой Ранее было показано, что проблемы с использованием опорно-двигательного Paradigm буриданова 3, а в нашей парадигмы, по сравнению с Кантона S, они показывают значительно снизилась передвижения. Мы всегда одичал организмов типа сначала, чтобы удостовериться, что условия и поведение в пределах нормы на данный день. Мы наблюдали отклонения от стандартных ответов менее чем 5% от тестирования дней. Эти различия могут быть классифицированы проблемы с параметрами нашего контролируемой среде.
Рисунок 1. ДИАС генерируемых следы и Кантон S диких мух типа (выше, слева) и опорно-двигательного-дефицитных dCASK Null мухи генерируется из перекрывающихся делеций (выше, справа). Следы представляют собой то, что видел в видеозаписи. Обе картины contrain следы от 8-10 мух работать в течение 30 секунд в анализе отслеживания видео следующие воздуха импульса.
Рисунок 2. Дикие мухи типа были проведены в опорно-двигательного анализа (см. выше) после импульса воздуха (фиолетовый бары) и без воздуха импульса (синий). Во всех параметров рассчитывается путем анализа программы, не было никаких существенных различий между этими двумя условиями (определяется с двумя хвостами студент т-тест). Это свидетельствует о том, что после импульса воздухе, летит передвигаться как правило, в нашей установке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашей установке умеренно сильный воздушный импульс временно останавливает летать движения. Когда импульс воздух заканчивается, мухи освобождаются от этого стационарного состояния и передвигаться нормально, как показано на рисунке 2. Потому что этот импульс воздуха эффективно синхронизирует передвижения населения, мы используем его, чтобы начать судебный процесс, чтобы мы могли ознакомиться также с началом движения следующие импульса нарушение стимул. Анализа, однако, может быть сделано без воздушного импульса с опорно-двигательной параметры после начала не влияют на воздушные импульса (рис. 2).
Одним из наиболее часто возникающие проблемы видели с автоматизированного анализа передвижения является вопрос о столкновениях. Отслеживание программ по большей части как известно, плохо дело с мухами, которые сталкиваются. Эти программы часто теряют "взгляд" из объекта на мгновение во время столкновения, а после обнаружения данного объекта пометьте его как новый объект. Результат может быть выход, который имеет гораздо больше объектов, чем на самом деле прослеживается существуют в камере. Многие люди решают эту проблему, трассировка одной мухи. Очевидная проблема с этим, однако, является то, что поведение одного летать может быть очень отличается от поведения населения в связи с ролью социальные реплики дрозофилы поведения и передвижения 4. Это, конечно, не обязательно плохо, в зависимости от того, что вы пытаетесь учиться, но для наших целей, мы предпочитаем использовать популяции мух увеличить нашу статистическую мощность. Из-за этого, мы имеем дело со столкновениями в двух направлениях. Во-первых, мы используем только 8-10 мух в суде (в нашем 56 мм кв камеры), так что столкновения будут минимальными. Во-вторых, в наших тридцать второго испытания, мы только анализировать следы, которые, по крайней мере 18 секунд в длину. Делая это, мы всегда записи достаточно времени, чтобы захватить несколько приступов движения в полном объеме. Это также гарантирует, что наша выборка всегда отражает количество мух в камере, а более мелкие фрагменты движения отбрасываются и общая длина видео составляет всего 30 секунд.
Анализ данных может быть самой сложной частью всего этого процесса. Наиболее важным шагом в анализе отслеживания данных, чтобы определить разницу между шумом и движением. ДИАС (как и многие другие программы), почти никогда не выход скорости от 0 мм / с, даже если муха перестала двигаться. Из-за этого, важно, чтобы посмотреть видео, глядя на кадр вывода данных за кадром, чтобы увидеть, когда организмы на самом деле в движении, и когда они таковыми не являются. В нашей установке всех скоростях ниже 1 мм / с, кажется, шум, который соответствует тому, что другие группы, использующие ДИАС нашли взрослых мух 1. Для глядя на динамику боя структуру, необходимо также определить боя. Мы определяем деятельность в качестве 3 или более последовательных кадров скорости выше 1 мм / с, и бездействие, как 3 или более последовательных кадров ниже этого порога.
Данные также должны быть надлежащим образом сглаженные для устранения артефактов из переходных мерцающий свет и камеры искажений, которые иногда происходят. Существует нет стандартного метода сглаживания данных, но важно, чтобы процесс сглаживания не меняет общей тенденции данных слишком резко, или можно генерировать сглаживания артефактов. Мы дважды с гладкой окно Тьюки из "5,15,60,15,5", потому что кажется, чтобы устранить любые большие скачки или изменения в скорости, что явно не так, но не меняет общей тенденции или характер данных.
Важно признать, что различные установки и окружающей среды, дадут различные поведенческие результаты. Наша рекомендация никому создании отслеживания анализа является экспериментировать со всеми этими вопросами, пока не найдете способ, который обеспечивает данные, которые соответствуют тому, что видно визуально, а затем как можно более последовательными в лечении все данные в том же порядке.
Выбор правильной программы слежения, также важно. Хотя мы используем ДИАС 3,2 (www.solltechnologies.com), это отнюдь не лучшее или только система доступна. Для отслеживания одной мухи, Дэн Валенте (Митра Лаборатории Колд Спринг Харбор) разработала программу под названием Ftrack. Для нескольких мух locomoting вместе (т.е. там, где столкновения могут произойти), Кристин Брэнсон (Dickinson / Перона Labs, Caltech) разработала программу под названием Ctrax. Ftrack можно получить на www.chronux.org, в то время Ctrax можно получить на www.dickinson.caltech.edu / Аналитика / Mtrax. Ethovision программное обеспечение (Noldus, Нидерланды) является еще одним мощным вариантом для видео-сопровождение и одного или нескольких мух, но это только в продаже, и стоит достаточно дорого.
Если вы настроили отслеживание анализа и не могут получить достоверную записи, Есть несколько вещей, чтобы рассмотреть. Суточный ритм вопросы часто большая проблема. При запуске поведенческие тесты, всегда следует убедиться, что не бегать мухи во время полуденной сиесты. Так как мы Официальнntly заинтересованы в генах, которые могут производить снижение опорно-двигательного поведения, мы предпочитаем работать мухи возле поздний пик активности днем (ZT 8-10). Еще одна проблема может возникнуть и из несовместимых воздушный поток от источника. Перед началом испытаний, убедитесь, что для проверки воздушного потока с расходомером, так что она не будет колебаться значительно более 15-секундный импульс воздуха. И наконец, генетический фон может играть роль во всех поведенческих задач, поэтому некоторые параметры этого анализа, возможно, должны быть оптимизированы для конкретного фона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья Грант R01 GM54408 присуждена LC Гриффит. Мы хотели бы поблагодарить Фреда Вольфа за всю его помощь в проектировании наш квадрат камеры и создания нашего анализа, Фрэнк Мелло в машине Brandeis University магазин для построения нашей камере, и Дэн Валенте и Тим Lebestky за полезные разговоры относительно анализа проблем.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
