عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Summary

دراسة السلوك الحركي المعقد في

Abstract

الذباب تقدم نموذجا مهما لدراسة سلوك معقد بسبب وفرة من الأدوات الجينية المتاحة للباحثين في هذا المجال. دراسة السلوك الحركي في

Protocol

الجزء 1 : إدارة التغذية والذباب

1. وينبغي أن نمت الذباب في الزجاجات التي تحتوي على الخميرة خالية من وسائل الاعلام القياسية. سوف تحتاج أعداد كبيرة من الذباب ، لذلك تحتاج إلى الصلبان تقام وفقا لذلك. وينبغي أن نمت الذباب في ضوء لمدة 12 ساعة : دورة في الظلام 25 درجة مئوية.
2. وينبغي أن تجمع الذباب بعد فترة وجيزة eclosion (1-3 أيام). ويمكن عمل مع الذباب في هذه المرحلة باستخدام الناشر ثاني أكسيد الكربون ، وينبغي أن تفرز وتوضع في أنابيب اختبار تحتوي على وسائل الإعلام أو تعقيمها الخميرة الحرة. نستخدم الذكور فقط ، وتخزن 10 إلى أنبوب اختبار.
3. تسمح على الاقل يوم او يومين بعد استخدام غاز ثاني أكسيد الكربون قبل تشغيل التجارب السلوكية. نركض الذباب في مقايسة لدينا السلوكية 3-5 أيام التالية ECLOSION.
4. وينبغي دائما أن يتم المقايسات ضمن نفس الإطار الزمني 2-3 ساعة كل يوم لتجنب المشاكل الإيقاعي.

الجزء 2 : إعداد نظام التتبع في بيئة تسيطر عليها

1. جميع التجارب تتم في غرفة البيئة التي تحافظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية مع رطوبة 70 ٪.
2. تعليق كاميرا الفيديو الرقمية على المنطقة التي سيتم تسجيلها (الكاميرا إلى أسفل). منذ لدينا برامج التعقب القائمة على النقيض ، ونحن تعليق الكاميرا على ضوء مربع. الكاميرا السجلات الفيديو مباشرة على جهاز كمبيوتر Dell عبر اتصال فايرواير. نستخدم شارب كاميرا الفيديو الرقمية ، والتوصيل إلى جهاز كمبيوتر Dell مع المخرج الوثائقي ويندوز (فيستا إصدار) لاقتناء الفيديو.
3. وسوف تدار البقول الجوية في هذا البروتوكول ، لذلك مصدرا لتدفق الهواء يجب أن تكون موجودة في الغرفة. استخدام أنابيب مطاطية ، وربط مصدر الهواء لمرشح الكربون لتنقية الهواء.
4. استخدام المزيد من الأنابيب المطاطية وربط الجانب الآخر من فلتر الكربون إلى دورق مخروطي عبر سدادة مطاطية جوفاء ، وملء قارورة مع حوالي نصف بوصة من الماء. وهذا ترطيب الهواء.
5. ينبغي أن يكون لها أيضا القارورة أسلحة شخصية ، والتي سوف تتصل على شكل صمام Y عبر أنابيب مطاطية.
6. يجب أن تكون متصلا فرع واحد من صمام - Y لمقياس الجريان. وينبغي أن الفرع الآخر تسليم الهواء الى الغرفة تحرك مربع.

الجزء 3 : تحقيق الذباب تنقل الى الغرفة

1. ويستند الغرفة تحرك مربع على التصميم من وولف وآخرون 2002 ¹ ، مع إضافة قطرة صغيرة من الصواني لمنع الذباب من التحليق داخل الغرفة. ينبغي أن تؤخذ في غرفة على حدة ، وينبغي أن تكون جميع مكونات تمحى تماما أسفل مع الايثانول 70 ٪ وتجفف قبل الاستخدام.
2. ويمكن على الفور التخدير قبل إجراء أي فحص السلوكية تسوية محتملة الأداء. لتجنب هذا الأمر ، وطرقت برفق الذباب في الغرفة باستخدام القمع مع منفذ صغير. لجعل متنفسا من الحجم الصحيح ، إرفاق تلميح ماصة الزرقاء (لP1000) إلى نهاية القمع. استخدام مقص لقطع في نهاية جدا من طرف ماصة لجعل افتتاح كبيرة بما يكفي لتطير بالمرور.
3. الجزء العلوي من الغرفة لدينا هو قطعة صغيرة من زجاج شبكي تأمينها بواسطة براغي حول حواف. عندما تتم إزالة مسامير ، ويمكن استخدام فتحات لتوصيل الذباب في الغرفة. موقف الأعلى شبكي بحيث ثقب المسمار يجلس مباشرة على الحجرة الداخلية بدلا من المسمار حيث يجلس عادة. اخذت انبوب اختبار يحتوي على الذباب ووضعه رأسا على عقب على القمع ، الذي يجب أن ثم توضع في ثقب المسمار.
4. لا تحرك القمع ، وهذا يمكن أن يضر أو ​​ضرر الذباب. بدلا من ذلك ، فرقعة بلطف غرفة بأكملها ، قمع وكل شيء ، حتى عن الذباب داخل الغرفة. وينبغي أن يتم هذا يطرق على لوحة الماوس لاستيعاب الصدمة من هذا ضجيجا. عندما يطير في الداخل ، وإزالة القمع ، وإعادة مكانة أعلى شبكي على سرير المسمار. ثم إعادة المسمار أعلى زجاج شبكي في مكانها.

الجزء 4 : تشغيل الفحص الحركي

1. مرة واحدة يتم تحميلها بشكل صحيح الذباب ، والسماح لهم يتأقلم في غرفة لمدة 30 دقيقة. يجب أن تكون فترة تأقلم تجري في بيئة تسيطر عليها (25 درجة مئوية والرطوبة 70 ٪) ، وينبغي أن توضع في غرفة على أعلى مربع الضوء (التي تحولت ينبغي على). بدوره قبالة أضواء الغرفة الأخرى.
2. بعد فترة التأقلم ، Y - تبديل صمام في نظام تدفق الهواء مثل الهواء الذي سوف تتدفق فقط على مقياس الجريان. بدوره على الهواء ، والمنحدر في الهواء تصل إلى سرعة المطلوب (4،0-6،0 لتر / دقيقة). نستخدم عادة 5،0-5،5 لتر / دقيقة ، ولكن بأي سرعة العمل في هذا النطاق سوف.
3. حالما يتم بلوغ السرعة المطلوبة ، Y - تبديل صمام بحيث تدفق الهواء الى الغرفة الحركة. هذه المرة نبض الهواء لمدة 15 ثانية ، ثم تحول فجأة في الهواء خارج. كما تقوم بدورها في الهواء خارج ، والتبديل الكاميرا لتسجيل واسطة. (هذا الجزء يأخذ في ممارسة وفعل في كل مرة).
4. بعد إيقاف التسجيل في الوقت المطلوب وحفظ. نسجل 30 تجربة ثانية في 10 لقطة في الثانية (على الأقل 8 محاكمات في النمط الوراثي).

الجزء 5 : تحليل الفيديو

1. نستخدمدينامية نظام تحليل الصور (DIAS) والبرمجيات 3.2 لتعقب الحركة ^2. من أجل استخدام هذا البرنامج ، ونحن لدينا أولا تحويل أشرطة الفيديو إلى تنسيق ملف AVI مع كويك تايم 7.5.5.
2. لتعقب الذباب على أساس النقيض من ذلك ، علينا أن نستخدم "Autotrace بواسطة عتبة" وظيفة. ثم نستخدم "جعل من تتبع مسار" وظيفة لآثار هذه رقمنة.
3. لإخراج بسرعة لحظية لكل يطير ، ونحن استخدام "حساب معلمات" وظيفة لإنتاج ملف قاعدة بيانات (DIAS محددة). باستخدام هذه الوظيفة ، ونحن أيضا السلس للبيانات باستخدام "5،15،60،15،5" نافذة تجانس توكي.
4. بمجرد أنتج هذه المعلومات كملف قاعدة بيانات ، يمكن فتحه في Microsoft Excel. نستخدم النصي مطلب ترجمة فورية بسرعة داخل التفوق وحساب المعلمات إضافية ضرورية لفهم ديناميات الحركة وبنية المباراة.

ممثل النتائج :

الشكل 1 يبين آثار من الكائنات البرية ممثل كانتون نوع S (الشكل 1 ، اللوحة اليسرى) والذباب فارغة لهذا الجين dCASK التي تم إنشاؤها بواسطة معبر الكبيرتين الحذف المتداخلة (مدافع (3R) x307 ومدافع (3R) x313) (الشكل 1 ، اللوحة اليمنى). الذباب فارغة dCASK سبق تبين أن لديهم مشاكل الحركي باستخدام النموذج Buridan في ³ ، ونموذج لدينا ، بالمقارنة مع كانتون S ، وتبين أنها انخفضت إلى حد كبير الحركة. نحن دائما تشغيل نوع الكائنات البرية أولا للتأكد من أن الظروف والسلوك هي ضمن المعدل الطبيعي في يوم معين. وقد لاحظنا من الردود الانحرافات المعيارية في أقل من 5 ٪ من أيام الاختبارات. عادة هذه الاختلافات يمكن أن يعزى إلى مشاكل مع معلمات بيئتنا للرقابة.

الشكل 1. DIAS المولدة آثار كل من كانتون الذباب نوع S البرية (أعلاه ، الى اليسار) والحركي التي تعاني من نقص خالية dCASK الذباب الناتجة عن التداخل الحذف (أعلاه ، الحق). وتمثل آثار ما ينظر إليه في أشرطة الفيديو المسجلة. كلا contrain آثار صور 8-10 الذباب تشغيل لمدة 30 ثانية في شريط الفيديو بعد فحص تتبع نبض الهواء.

الشكل 2. تم تشغيل رحلات البرية في نوع الفحص الحركي (أعلاه) بعد نبض الهواء (قضبان الأرجواني) ، ودون وجود نبض الهواء (الأزرق). في جميع المعلمات وتحسب على أساس برنامج للتحليل ، لم تكن هناك اختلافات كبيرة بين الحالتين (مصممون مع اثنين من الذيل الطالب اختبار t). هذا يدل على أنه في أعقاب نبض الهواء ، والذباب locomote عادة في الإعداد لدينا.

Discussion

في الإعداد لدينا ، نبضة جوية قوية معتدل عابر توقف حركة الطيران. عندما تنتهي نبض الهواء ، يتم الإفراج عن الذباب من هذه الولاية الثابتة وlocomote عادة ، كما هو مبين في الشكل 2. لأن هذا يتزامن نبض الهواء تحرك فعال من السكان ، ونستخدمها لبدء المحاكمة حتى يتسنى لنا دراسة أيضا ظهور الحركة التالية حافزا لكسر زخم. يمكن للمقايسة ومع ذلك ، ينبغي القيام به من دون نبض الجوية منذ بدء المعلمات الحركي التالية لا تتأثر نبض الهواء (الشكل 2).

كثيرا ما تحدث مشكلة واحدة مع رؤية التحليل الآلي للتحرك هو مسألة التصادم. برامج التتبع هي بالنسبة للجزء الاكبر سيئا في التعامل مع الذباب الذي تتصادم. هذه البرامج غالبا ما يفقد "الأفق" للكائن حظات أثناء الاصطدام ، وعند العثور على هذه التسمية الكائن على أنه كائن جديد. يمكن أن تكون النتيجة أن يبلغ حجم انتاجها والعديد من الكائنات من تتبع فعليا موجود في الغرفة. كثير من الناس في حل هذه المشكلة عن طريق تتبع الذباب واحد. المشكلة واضحة مع هذا ، ومع ذلك ، هو أن السلوك ذبابة واحدة قد تكون مختلفة تماما عن سلوك السكان نظرا لدور العظة الاجتماعية في السلوك الحركي وذبابة الفاكهة ^4. هذا هو ، بالطبع ، وليس بالضرورة أمرا سيئا ، اعتمادا على ما كنت تحاول الدراسة ، ولكن لأغراضنا ، فإننا نفضل استخدام السكان من الذباب لزيادة قوتنا الإحصائية. وبسبب هذا ، ونحن نتعامل مع الاصطدامات بطريقتين. أولا ، نحن نستخدم فقط 80-10 الذباب في محاكمة (لدينا في غرفة مربعة 56 ملم) ، لذلك سوف يكون ضئيلا للغاية أن الاصطدامات. الثانية ، في إطار محاكمات thirty الثاني لنا ، نحن نحلل فقط أن يتتبع ما لا يقل عن 18 ثانية في الطول. من خلال ذلك ، ونحن دائما تسجيل ما يكفي من الوقت لالتقاط موجات متعددة من الحركة في مجملها. هذا يضمن أيضا أن حجم العينة لدينا دائما يعكس عدد من الذباب في الغرفة ، كما يتم التخلص من أجزاء أصغر من الحركة ويبلغ طول شريط الفيديو هو 30 ثانية فقط.

ويمكن تحليل البيانات أن الجزء الأكثر صعوبة في هذه العملية برمتها. أهم خطوة لتحليل بيانات تتبع لتحديد الفرق بين الضجيج والحركة. سوف DIAS (مثل العديد من البرامج الأخرى) تقريبا أبدا إخراج سرعة 0 مم / ثانية ، حتى لو كان يطير توقف التحرك. وبسبب هذا ، من المهم لمشاهدة أشرطة الفيديو في حين يبحث في بيانات الإطار من جانب الإطار الإخراج عندما انظر الى الكائنات هي في الواقع في الحركة ، وعندما لا يكونون. في الإعداد لدينا ، جميع سرعات أقل من 1 ملم / ثانية يبدو أن الضوضاء ، وهو ما يتسق مع المجموعات الأخرى باستخدام ما وجدت DIAS الذباب مع الكبار ^1. للنظر في ديناميات الهيكل نوبة ، ويحتاج المرء أيضا إلى تعريف نوبة. كما نعرف النشاط 3 أو أكثر الأطر متتالية من سرعة أعلى من 1 ملم / ثانية ، والخمول و3 أو أكثر من الإطارات على التوالي دون هذه العتبة.

ويجب أيضا أن تكون البيانات بشكل صحيح ممهدة للقضاء على التحف من الخفقان ضوء عابر الكاميرا والتشوهات التي تحدث في بعض الأحيان. لا توجد طريقة قياسية لتجانس البيانات ، ولكن من المهم أن عملية التنعيم لا يغير الاتجاه العام للبيانات بشكل كبير جدا ، أو واحد يمكن أن يولد التحف التنعيم. نحن السلس مرتين مع نافذة من توكي "5،15،60،15،5" ، لأنه يبدو للقضاء على أي قفزات كبيرة أو تغيرات في السرعة التي يتم خاطئ بشكل واضح ، ولكن لا يغير الاتجاه العام أو طبيعة البيانات.

من المهم أن ندرك أن الاجهزة المختلفة والبيئات ستنتج نتائج سلوكية مختلفة. توصيتنا لأحد وضع مقايسة تتبع هو أن التجربة مع كل من هذه القضايا حتى تجد الطريقة التي تنتج البيانات التي تتوافق مع ما يمكن رؤيته بصريا ، ومن ثم تكون متسقة قدر الإمكان في معالجة كافة البيانات في نفس الطريقة.

اختيار البرنامج تتبع الحق هو مهم أيضا. على الرغم من أننا استخدام DIAS 3.2 (www.solltechnologies.com) ، وهذا هو بأي حال من الأحوال أفضل أو النظام الوحيد المتاح. لتتبع من الذباب واحد ، وقد وضعت دان فالنتي (ميترا مختبر ، CSHL) برنامج يسمى Ftrack. ذباب locomoting متعددة معا (أي ، حيث قد تحدث اصطدامات) ، وقد وضعت كريستين برانسون (ديكنسون / Perona مختبرات ، معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) في برنامج يسمى Ctrax. Ftrack يتوفر في www.chronux.org ، في حين يتوفر في Ctrax www.dickinson.caltech.edu / البحث / Mtrax. Ethovision البرمجيات (Noldus ، هولندا) هو خيار آخر متاح لتعقب قوية الفيديو على حد سواء من الذباب واحد ومتعددة ، ولكنها الوحيدة المتاحة تجاريا ، ويعد مكلفا للغاية.

إذا كان لديك اقامة تتبع وفحص لا يمكن الحصول على تسجيلات موثوق بها ، وهناك بضعة أشياء للنظر فيها. قضايا الإيقاعي وغالبا ما تكون مشكلة كبيرة. عند تشغيل المقايسات السلوكية ، وينبغي للمرء دائما التأكد من عدم الترشح الذباب خلال القيلولة في منتصف النهار بهم. بما أننا currently المهتمة في الجينات التي يمكن أن تنتج النقصان في السلوك الحركي ، ونحن نفضل أن تشغيل الذباب بعد ظهر اليوم بالقرب من ذروة النشاط في وقت متأخر (ZT 8-10). يمكن أن تنشأ مشكلة أخرى أيضا من تدفق الهواء غير متناسقة من المصدر. قبل بدء المحاكمات ، تأكد لاختبار تدفق الهواء مع مقياس الجريان ، بحيث أنها لن تتذبذب بشكل كبير على مدى 15 نبضة جوية ثانية. أخيرا ، يمكن للخلفية الوراثية تلعب دورا في جميع المهام السلوكية ، وحتى بعض المعلمات من هذا الاختبار قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل لخلفية معينة.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Square Chamber	Tool	Machine Shop	N/A	Design from Wolf et al. 20021
Digital Camera	Camera	Sharp	ViewcamZ VL-23
Flowmeter	Tool	Cole-Parmer	SY-32003-12
Light Box	Tool	DNASTAR	Seq-Easy
Charcoal Filter	Tool	Fisher Scientific	09-744-37
DIAS 3.2	Software	Soll technologies	N/A	www.solltechnologies.com