Summary
I studien av komplexa rörelseorganen beteende i
Abstract
Flugor ge en viktig modell för att studera komplext beteende på grund av den uppsjö av genetiska verktyg tillgängliga för forskare inom detta område. Studera rörelseorganen beteende i
Protocol
Del 1: Utfodring och hantering av flugor
- Flugor bör odlas i flaskor som innehåller jäst-fri standard medier. Du kommer att behöva stora mängder av flugor, så kors måste ställa upp för ändamålet. Flugor bör odlas i ett 12-timmars ljus: mörker-cykel vid 25 º C.
- Flugor ska samlas snart efter eclosion (1-3 dagar). Flugor kan bearbetas med i detta skede med hjälp av en diffuser koldioxid och bör sorteras i provrör som innehåller autoklaveras eller jäst-fria medier. Vi använder endast män, lagras 10 till ett provrör.
- Lämna minst en dag eller två efter användning av koldioxid innan du kör beteende experiment. Vi driver flugor i våra beteende-analys 3-5 dagar efter ECLOSION.
- Analyser bör alltid göras inom samma 2-3 timmars fönstret varje dag för att undvika dygnsrytm frågor.
Del 2: Ställa in tracking system i en kontrollerad miljö
- Alla experiment sker i en miljö rum som håller en konstant temperatur på 25 º C med 70% luftfuktighet.
- Häng en digital videokamera över området som skall spelas in (kamera nedåt). Eftersom vår mjukvara är kontrast-baserad stänger vi kameran över en ljuslåda. Kameran registrerar videor direkt på en Dell-dator via en FireWire-anslutning. Vi använder en Sharp digital videokamera, ansluten till en Dell-dator med Windows Moviemaker (Vista-versionen) för video förvärvet.
- Air pulser kommer att administreras i detta protokoll, så en källa för luftflödet måste finnas i rummet. Använda gummislang, anslut luften källan till ett kolfilter för luftfiltrering.
- Använda mer gummislang och ansluta den andra sidan av kolfilter till en Erlenmeyerkolv via en ihålig gummipropp och fyll kolven med ca en halv cm vatten. Detta kommer att fukta luften.
- Kolven bör också ha en pistol, som kommer att ansluta till en Y-formad ventilen via gummislang.
- En gren av Y-ventilen ska vara ansluten till en flödesmätare. Den andra grenen bör leverera luft till torget rörelseorganen kammaren.
Del 3: Leverera flyger till rörelseorganen kammaren
- Torget förflyttning kammaren bygger på designen från Wolf et al. 2002 1, med tillägg av liten droppe brickor för att hindra flugorna från att flyga i kammaren. Kammaren bör tas isär, och alla komponenter bör noggrant torkas av med 70% etanol och torkas före användning.
- Anestesi omedelbart innan de utför ett beteende analys kan potentiellt äventyra prestanda. För att undvika detta är flugor försiktigt knackade in i kammaren med hjälp av en tratt med ett litet uttag. För att göra ett uttag av rätt storlek, bifoga en blå pipettspets (för P1000) till slutet av en tratt. Använd sax för att klippa bort alldeles i slutet av pipettspetsen för att göra öppningen tillräckligt stor för en fluga att passera.
- Toppen av vår kammare är en liten bit plexiglas säkras genom skruvar runt kanterna. När skruvarna är borttagna, kan hålen användas för att leverera flyger in i kammaren. Placera plexiglas toppen så att skruvhålet sitter direkt över den inre kammaren i stället för att var en skruv som normalt sitter. Ta ett provrör innehållande flugor och placera den upp och ner över tratten, som sedan ska placeras in i skruvhålet.
- Flytta inte tratten, eftersom det kan skada eller skada flugor. Istället försiktigt bang hela kammaren, tratt och allt, tills alla flugor är inne i kammaren. Detta knackar bör göras på en musmatta för att absorbera stötar av denna banka. När flugor är inne, ta bort tratten, och åter placera plexiglas topp över skruven sängar. Sedan åter skruva fast plexiglas toppen på plats.
Del 4: Köra rörelseorganen analys
- När flugorna är ordentligt laddade, låt dem acklimatisera sig i kammaren i 30 minuter. Denna acklimatisering period bör ske i kontrollerad miljö (25 º C, 70% luftfuktighet), och kammaren ska placeras på toppen av ljuslåda (som ska vara påslagen). Vänd andra rummet belysningen.
- Efter acklimatisering perioden, växla Y-ventilen i luftflödet systemet så att luften bara kommer att tillfalla flödesmätaren. Slå på luften, och ramp luften upp till önskad hastighet (4,0-6,0 l / min). Vi använder i allmänhet 5,0-5,5 l / min, men någon fart i det området kommer att fungera.
- När önskad fart har uppnåtts, växla Y-ventilen så att luften strömmar till rörelseorganen kammaren. Tid denna luft puls i 15 sekunder, och sedan plötsligt slå i luften av. När du slår i luften av, växla kameran till inspelningsläge. (Denna del kräver övning att göra allt på en gång).
- Stoppa inspelningen efter önskad tid och spara. Vi spelar in 30 sekunder prövningar vid 10 bildrutor per sekund (minst 8 försök per genotyp).
Del 5: Analys av videofilmer
- Vi använderDynamic Image Analysis System (DIAS) programvara 3,2 för rörelse spårning 2. För att kunna använda denna programvara, omvandlar vi först våra filmer till en AVI-format med Quicktime 7.5.5.
- Att spåra flyger bygger på kontrast, använder vi "autotrace av Threshold"-funktion. Vi använder sedan "Gör anslutningen från Trace"-funktion för att digitalisera dessa spår.
- För att mata den momentana hastigheter på varje fluga använder vi "Compute Parameters" funktion för att skapa en databasfil (DIAS-specifika). Med denna funktion, smidig vi också data med hjälp av en "5,15,60,15,5" Tukey Smoothing fönster.
- När denna information är matas ut som en databas fil, kan den öppnas i Microsoft Excel. Vi använder en Matlab skript för att sammanställa den momentana hastigheter inom Excel och beräkna ytterligare parametrar som behövs för att förstå rörelsedynamik och matchen struktur.
Representativa resultat:
Figur 1 visar representativa spår från vildtyps Canton S organismer (figur 1, till vänster) och flyger null för dCASK gen som genererats genom att korsa två stora överlappande deletioner (DF (3R) x307 och DF (3R) x313) (Figur 1 , höger panel). dCASK null flugor har tidigare visat sig ha rörelseaktivitet problem med Buridan är Paradigm 3, och i våra paradigm, jämfört med Canton S, visar de minskade kraftigt förflyttning. Vi kör alltid vildtyp organismer först se till att villkor och beteende är inom det normala intervallet på en viss dag. Vi har sett avvikelser från standard svar på mindre än 5% av testning dagar. Dessa skillnader kan oftast hänföras till problem med parametrarna för våra kontrollerad miljö.
Figur 1. DIAS-genererade spår av både Canton S vild typ flugor (ovan till vänster) och motorisk-brist dCASK Null flyger genereras från överlappande strykningar (ovan till höger). Spåren representerar vad ses i inspelade videor. Båda bilderna contrain spår 8 till 10 flugor springa i 30 sekunder i videon spårar analysen efter en luft puls.
Figur 2. Vildtyp flugor kördes i rörelseapparaten analys (ovan) efter en luft-puls (lila staplar) och utan en luft-puls (blå). I alla parametrar beräknas av analysen programmet fanns inga signifikanta skillnader mellan de två villkoren (bestäms med tvåsidiga Students t-test). Detta visar att efter en luft puls, flugor locomote normalt i vår inställning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår inställning, slutar en måttligt stark luftpuffar övergående fluga rörelse. När luften pulsen slutar, är de flyger ut från den stationära tillstånd och locomote normalt, vilket visas i figur 2. Eftersom detta luftpuffar effektivt synkroniserar rörelseorganen av befolkningen använder vi den för att starta rättegången, så att vi kan också studera uppkomsten av rörelsen efter en fart-breaking stimulans. Analysen kan dock göras utan en luft puls sedan rörelseapparaten parametrar efter påbörjad påverkas inte av luft puls (figur 2).
Ett vanligt förekommande problem som ses med automatisk analys av förflyttning är frågan om kollisioner. Tracking program är för det mesta notoriskt dålig på att hantera flugor som kolliderar. Dessa program förlorar ofta "syn" på ett objekt tillfälligt under en kollision, och på att hitta det här objektet etikett det som ett nytt objekt. Resultatet kan bli en effekt som har många fler objekt spåras än vad som faktiskt finns i kammaren. Många löser detta problem genom att spåra enskilda flugor. Det uppenbara problemet med detta är dock att enda fluga beteende kan vara mycket annorlunda än befolkningen som beror av den roll som sociala ledtrådar i Drosophila beteende och förflyttning 4. Detta är naturligtvis inte nödvändigtvis en dålig sak, beroende på vad du försöker studera, men för våra syften, vi föredrar att använda populationer av flugor att öka vår statistisk styrka. På grund av detta hanterar vi kollisioner på två sätt. Först använder vi bara 80-10 flugor per försök (i vårt 56 mm ² kammare), så att kollisioner kommer att vara minimala. För det andra inom vår 32:e försök, analyserar vi endast spår som är minst 18 sekunder långa. Genom att göra detta är vi inspelning alltid tillräckligt med tid att fånga flera anfall av rörelse i sin helhet. Det garanterar också att vår urvalsstorlek alltid återspeglar antalet flugor i en kammare, som mindre fragment av rörelse kasseras och den totala längden på videon är bara 30 sekunder.
Dataanalys kan vara den svåraste delen av hela denna process. Det viktigaste steget för att analysera spåra data är att avgöra skillnaden mellan buller och rörelse. Dias (liksom många andra program) kommer nästan aldrig ut med en hastighet på 0 mm / s, även om flugan har slutat röra på sig. På grund av detta är det viktigt att titta på video medan du tittar på utdata ruta för ruta för att se när organismerna faktiskt i rörelse, och när de inte är det. I vår inställning, alla hastigheter under 1 mm / s verkar vara buller, vilket är i linje med vad andra grupper med DIAS har funnit med vuxna flugor 1. För att titta på dynamiken i anfallen struktur, måste man också definiera en match. Vi definierar verksamheten som 3 eller fler i rad bilder av hastigheter över 1 mm / s, och inaktivitet som 3 eller fler på varandra följande bilder under denna gräns.
Uppgifterna måste också vara korrekt jämnas för att eliminera artefakter från övergående lätt flimmer och störningar kamera, som ibland inträffar. Det finns ingen standardmetod för data utjämning, men det är viktigt att utjämning inte ändrar den allmänna trenden i de uppgifter som alltför drastiskt, eller en kan generera utjämning artefakter. Vi släta två gånger med ett Tukey fönster "5,15,60,15,5", eftersom det verkar för att eliminera alla stora hopp eller förändringar i hastighet som är klart fel, men ändrar inte den övergripande trenden eller typ av uppgifter.
Det är viktigt att inse att olika uppställningar och miljöer kommer att producera olika beteendemässiga utfall. Vår rekommendation till alla att inrätta en tracking-analysen är att experimentera med alla dessa frågor tills du hittar en metod som ger data som matchar det kan ses visuellt, och sedan vara så konsekvent som möjligt i att behandla alla data på samma sätt.
Val av rätt tracking-program är också viktigt. Även om vi använder DIAS 3,2 (www.solltechnologies.com) är detta inte alls det bästa eller det enda systemet på marknaden. För spårning av enstaka flugor, har Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) utvecklat ett program som heter Ftrack. För flera flugor locomoting tillsammans (dvs där kollisioner kan uppstå), har Kristin Branson (Dickinson / Perona Labs, Caltech) utvecklat ett program som heter Ctrax. Ftrack finns på www.chronux.org, medan Ctrax finns på www.dickinson.caltech.edu / Forskning / Mtrax. Ethovision programvara (Noldus, Nederländerna) är ett annat kraftfullt alternativ tillgängligt för video-spårning av både enstaka och multipla flugor, men det är bara kommersiellt tillgängliga, och är ganska dyr.
Om du har inrättat en spårning analys och inte kan få tillförlitliga registreringar, finns det några saker att tänka på. Dygnsrytm är ofta ett stort problem. När du kör beteendemässiga analyser bör man alltid se till att inte köra flugor under middagstid siesta. Eftersom vi är Currently intresserade av gener som kan producera minskar i rörelseapparaten beteende, föredrar vi att köra flugor nära sent på eftermiddagen verksamheten topp (ZT 8-10). Ett annat problem kan också uppstå inkonsekvent luftflöde från källan. Innan du börjar studierna ska du testa luftflöde med flödesmätare, så att det inte kommer att fluktuera kraftigt under 15 sekunder luften puls. Slutligen kan genetisk bakgrund spela en roll i alla beteende uppgifter, så några av parametrarna i denna analys kan behöva optimeras för en viss bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant R01 GM54408 tilldelas LC Griffith. Vi vill tacka Fred Wolf för all hans hjälp med att utforma våra torg kammare och sätta upp vår analys, Frank Mello vid Brandeis University mekanisk verkstad för att bygga vår kammare, och Dan Valente och Tim Lebestky för bra samtal om analys frågor.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
