Summary
에서 복잡한 운전하는 동작의 연구
Abstract
파리는이 분야에서 연구자에게 제공 유전 도구의 과다로 인해 복잡한 동작을 연구에 중요한 모델을 제공합니다. 에서 전위의 행동을 공부
Protocol
1 부 : 파리의 수유 및 관리
- 파리는 누룩없는 표준 매체를 포함하는 병 재배한다. 당신은 파리의 큰 숫자가 필요합니다, 그래서 십자가는 적절하게 설정해야합니다. 25 º C.에 어두운주기 : 파리는 12 시간 조명으로 성장해야
- 파리는 (1-3일) 곧 eclosion 후 수집되어야합니다. 파리는 이산화탄소 디퓨저를 사용하여이 단계에서 같이 일한 수 있으며, autoclaved 또는 효모없이 미디어를 포함하는 테스트 튜브로 정렬되어야합니다. 우리는 테스트 튜브에만, 저장 남성 10를 사용합니다.
- 행동 실험을 실행하기 전에 이산화탄소의 사용 후 적어도 하루나 이틀이 소요됩니다. 우리는 ECLOSION 다음 3-5일 우리의 행동 분석에 파리를 실행합니다.
- Assays 항상 circadian 리듬에 문제가 발생하지 않도록 동일한 2-3시간 시간 창 매일 내에서 이루어져야한다.
2 부 : 제한된 환경에서 추적 시스템을 설정
- 모든 실험은 70 % 습도가 25 º C의 일정한 온도를 유지하는 환경 룸에서 이루어집니다.
- (카메라가 아래쪽으로 향하게) 기록으로 그 지역에있는 디지털 비디오 카메라를 일시 중지합니다. 우리 추적 소프트웨어가 대비 기반이기 때문에, 우리는 가벼운 상자를 통해 카메라를 일시 중지합니다. 카메라 기록 동영상 직접 FireWire를 연결을 통해 델 컴퓨터에. 우리는 비디오 수집에 대해 Windows 영화 제작자와 델 컴퓨터에 매여 급 디지털 비디오 카메라를 (비스타 버전)을 사용합니다.
- 에어 펄스가이 프로토콜에 실시되고, 공기 흐름에 대한 소스가 방에 존재되어야한다. 고무 튜브를 사용하여 공기 정화를위한 탄소 필터 공기 소스를 연결합니다.
- 더 고무 튜브를 사용하면, 중공 고무 마개를 통해 Erlenmeyer 플라스크에 필터 탄소의 다른 측면을 연결하고 물을 한 30 인치와 술병을 입력합니다. 이것은 공기를 ...을 축이다 것입니다.
- 플라스크는 고무 튜브를 통해 Y - 모양의 밸브에 연결하는 권총을 가지고해야합니다.
- Y - 밸브 중 하나 지점은 유량계에 연결되어 있어야합니다. 다른 지점은 사각형 운동 챔버에 공기를 제공해야합니다.
파트 3 : 운동 챔버에 파리를 제공
- 사각형 운동 챔버는 늑대 외의 디자인을 기반으로합니다. 2002 1, 챔버 내의 비행에서 파리를 방지하기 위해 작은 드롭 트레이를 추가. 챔버는 따로 복용해야하고, 모든 구성 요소는 철저하게 70 %의 에탄올과 함께 닦여 및 사용하기 전에 건조해야합니다.
- 즉시 행동 분석을 실시하기 전에 마취는 잠재적으로 성능을 손상하실 수 있습니다. 이것을 방지하려면, 파리는 부드럽게 작은 콘센트가있는 깔때기를 사용하여 챔버에 기절입니다. 오른쪽 크기의 콘센트를 확인하려면, 퍼널의 끝에 파란색 피펫 팁을 (P1000)을 첨부합니다. 통과 비행 충분한 자리가 크게 만들기 위해 피펫 팁의 가장 끝부분을 잘라 가위를 사용합니다.
- 우리 챔버의 상단 가장자리 나사에 의해 보안 플렉시 글라스의 작은 조각이다. 나사가 제거되면, 구멍은 챔버에 파리를 전달하는 데 사용할 수 있습니다. 나사 구멍은 나사가 정상적으로 자리가 어디 대신 내부 챔버를 통해 직접 앉아 있도록 플렉시 글라스의 위로 위치. 파리가 들어있는 시험관을 가지고 다음 나사 구멍에 배치되어야하는 깔때기, 위에 뒤집어 놓으십시오.
- 이것은 파리를 다치게하거나 손상될 수 있듯이, 깔때기를 이동하지 마십시오. 모든 파리는 챔버 내부에까지 대신, 부드럽게, 모든, 전체 챔버 쾅 퍼널합니다. 이것은 노킹이 닌가의 충격을 흡수하기 위해 마우스 패드에서 수행되어야합니다. 파리 안에되면 깔때기를 제거하고 나사 침대 위에 다시 위치 플렉시 글라스 톱. 장소에 다음 다시 나사 플렉시 글라스 톱.
파트 4 : 전위의 어세를 실행
- 파리가 제대로로드되면, 그들이 30 분 동안 챔버에 순응하자. 이 acclimation 기간은 통제된 환경 (25 º C, 70 % 습도)에 자리을해야하고, 챔버는 (어떤 기능이 설정되어 있어야 함) 빛의 상자의 상단에 위치해야합니다. 다른 방에 불을 끄십시오.
- acclimation 기간에 따라, 공기만을 유량계로 유량 것이다 이러한 공기 흐름 시스템의 Y - 밸브를 전환합니다. 공기 켜고하고 원하는 속도 (4.0-6.0 L / 분)로 공기를 램프. 우리는 일반적으로 5.0-5.5 L / 분,하지만 그 범위에 속도가 작동을 사용합니다.
- 원하는 속도는이 달성되면 공기가 운동 챔버에 흐르는 있도록 Y - 밸브를 전환합니다. 시간이 공기 15 초 동안 맥박, 그리고 갑자기 공기를 끄십시오. 당신이 공기를 끌로 모드를 기록하는 카메라를 전환합니다. (이 부분은 한 번에 모든 것을 할 연습이 필요).
- 원하는 시간 후에 녹화를 중지하고 저장합니다. 우리는 초당 10 프레임 (유전자형 당 최소한 8 재판)에서 30초 재판을 기록합니다.
제 5 부 : 비디오 분석
- 우리는을 사용하여동적 이미지 분석 시스템 (이틀) 2를 추적하는 움직임을위한 소프트웨어 3.2. 이 소프트웨어를 사용하기 위해, 먼저 퀵타임 7.5.5로 AVI 파일 형식으로 우리의 동영상을 변환합니다.
- 반면에 따라 파리를 추적하기 위해, 우리는 기능 "임계값에 의해 Autotrace"를 사용합니다. 그러면 이러한 디지털화 흔적 함수를 "추적에서 확인 경로"를 사용합니다.
- 각 비행의 순간 속도를 출력하기 위해, 우리는 (이틀 특정) 데이터베이스 파일을 생성하기 위해 "컴퓨트 매개 변수"기능을 사용하십시오. 이 기능을 사용하여, 우리는 "5,15,60,15,5"Tukey 스무딩 창을 사용하여 데이터를 부드럽게.
- 이 정보는 데이터베이스 파일과 같은 출력되면, 그것은 Microsoft Excel에서 열 수 있습니다. 우리는 엑셀 이내에 순간 속도를 컴파일하고 운동 역학과 한판 승부 구조를 이해하는 데 필요한 추가 매개 변수를 계산 Matlab 스크립트를 사용합니다.
대표 결과 :
그림 1은 야생 유형 광동 S 생물 (그림 1, 왼쪽 패널)에서 대표 흔적을 보여주는 두 개의 대형 중복 삭제 (DF (3R) x307와 DF (3R) x313) (그림 1 횡단에 의해 생성되었습니다 dCASK 유전자에 대해 NULL을 날아 , 오른쪽 패널). dCASK의 NULL의 파리는 이전 광동 S에 비해 Buridan의 패러다임 3을 사용 전위의 문제가 같이 우리의 패러다임에있다, 그들은 크게 운동을 감소 보여줍니다. 우리는 항상 조건과 행동은 하루에 정상 범위 내에 있는지 확인 먼저 야생 타입 생물을 실행합니다. 우리는 시험 일의 5 % 미만의 표준 반응의 편차를 감찰하러 온 적도 있습니다. 이러한 차이는 일반적으로 우리가 통제 환경의 매개 변수 문제에 기인 수 있습니다.
그림 1. 디어스 생성 캔턴 S 야생 유형 파리 (위, 왼쪽)와 중복 삭제 (위, 오른쪽)에서 발생하는 전위의 - 결함 dCASK의 널 파리 모두의 흔적. 흔적이 기록된 동영상에서 본 것을 나타냅니다. 80-10 파리에서 두 사진 contrain의 흔적은 공기 펄스 다음 비디오 추적 분석에서 30 초 동안 실행됩니다.
그림 2. 와일드 타입 빠르다는 공기 펄스 (자주색 바) 다음과 같은 전위의 분석 (위)과 공기 펄스 (파란색)없이 실행되었습니다. 분석 프로그램에 의해 계산된 모든 매개 변수에서 두 가지 조건 사이에는 큰 차이가 (2 꼬리 학생 T - 테스트로 결정)가 없었다. 이것은 공기 펄스 다음, 우리 설정에서 일반적으로 locomote 빠르다 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리의 설치 프로그램에서 적당히 강한 공기 펄스 transiently 플라이 운동을 중지합니다. 공기 펄스가 끝날 때, 파리는 그림 2에 표시된이 고정 상태와 일반적으로 locomote에서 발표됩니다. 이 공기 펄스 효과적으로 인구의 운동을 동기화하기 때문에, 우리는 또한 모멘텀적인 자극의 다음과 같은 운동의 발병을 공부할 수 있도록 재판을 시작하기 위해 그것을 사용합니다. 개시 다음과 같은 전위의 매개 변수가 공기 펄스 (그림 2)에 의해 영향을받지되기 때문에 분석은하지만, 공기 펄스없이 할 수 있습니다.
운동의 자동 분석 본 한 자주 발생하는 문제는 충돌의 문제입니다. 추적 프로그램은 충돌 파리 처리에 악명 나쁜 대부분입니다. 이 프로그램은 종종 충돌하는 동안 일시적으로 객체의 "시력"을 잃게하고, 새로운 개체로이 개체 레이블을 찾는시. 그 결과 실제로 챔버에 존재하는 것보다 더 많은 개체 추적을 출력하실 수 있습니다. 많은 사람들이 하나의 파리를 추적하여이 문제를 해결. 이런 분명한 문제는, 그러나, 그 하나의 비행 행동은 Drosophila의 행동과 운동 4 사회적 단서의 역할로 인해 인구의 행동보다는 매우 다를 수 있습니다됩니다. 이것은 물론 공부하려고하는 내용에 따라, 나쁜 일이 반드시는 아니지만 우리의 목적을 위해, 우리는 우리의 통계 능력을 높이기 위해 파리의 인구를 사용하는 것을 선호합니다. 이 때문에, 우리는 두 가지 방법으로 충돌 처리합니다. 첫째, 우리는 시험 당 80-10 파리 (우리 56mm 평방 챔버)를 사용하므로 충돌이 최소화됩니다. 둘째, 우리 서른두번째 시련 이내에, 우리는 적어도 18초 길이에 흔적을 분석할 수 있습니다. 이렇게함으로써, 우리는 항상 전체 운동의 여러 관찰을 캡처하는 충분한 시간을 기록하고 있습니다. 이것은 또한 운동의 작은 조각은 삭제 및 비디오의 전체 길이는 30 초로되어 있으므로 샘플 크기는 항상 실내에있는 파리의 수를 반영 보장합니다.
데이터 분석이 전체 과정의 가장 어려운 부분이 될 수 있습니다. 추적 데이터를 분석의 가장 중요한 단계는 소음과 움직임의 차이를 결정하는 것입니다. 디어스은 (많은 다른 프로그램과 같은), 파리가 멈췄어 경우에도 0mm / s의 속도를 출력하지 거의 않습니다. 이 때문에, 그것은 유기체가 움직이는 때 실제로 볼 프레임으로 데이터를 출력 프레임 보면서 동영상을 시청하는 것이 중요합니다, 언제 그들이되지 않습니다. 우리 설정에서 1mm / s에서 아래의 모든 속도는 이틀을 사용하여 다른 그룹은 성인 파리 1 찾아낸 무엇과 일치 소음이 될 것 같습니다. 그럴때 구조의 역학에서 찾고, 어떤 사람은 시합을 정의해야합니다. 이 임계값 아래에 3 개 이상 연속 프레임으로 3 개 이상 연속 1mm / s의 속도 이상의 프레임과 비활성으로 활동을 정의합니다.
데이터는 제대로 과도 표시등 깜빡하고 때때로 발생하는 카메라 왜곡에서 유물을 제거하는 smoothed해야합니다. 이 데이터를 다듬기위한 표준 방법은 없지만, 그것은 스무딩 과정이 너무 크게 데이터의 일반적인 경향을 변경하지 않는 것이 중요합니다, 하나 스무딩 유물을 생성할 수 있습니다. 우리는 분명히 잘못 속도에 큰 점프 또는 변경 내용을 제거 것 때문에, "5,15,60,15,5"의 Tukey 윈도우로 두 번 부드럽게하지만, 데이터의 전반적인 경향이나 성격을 변경하지 않습니다.
다른 설정과 환경은 서로 다른 행동 결과를 생산할 것이라고 인식하는 것이 중요합니다. 당신이 일치하는 시각 본 다음 같은 방식으로 모든 데이터를 치료에 가능한 한 일치 될 수있는 데이터를 생산하는 방법을 찾을 때까지 추적 분석을 설정 사람에 대한 우리의 추천이 모든 문제와 함께 실험하는 것입니다.
오른쪽 추적 프로그램의 선택도 중요합니다. 우리가 디어스 3.2 (www.solltechnologies.com)를 사용하지만, 이것이없이는 사용할 수있는 최상의 또는 유일한 시스템을 의미하는 것입니다. 단일 파리의 추적, 댄 발렌테 (미트라 연구소, CSHL)는 Ftrack라는 프로그램을 개발했습니다. (충돌이 발생할 수 있습니다 즉,) 함께 locomoting 여러 날아 들어, 크리스틴 브랜슨 (디킨슨 / 페로나 연구소, Caltech)은 Ctrax라는 프로그램을 개발했습니다. Ctrax가 www.dickinson.caltech.edu / 리서치 / Mtrax에서 구할 수있는 동안 Ftrack는 www.chronux.org에서 사용할 수 있습니다. Ethovision 소프트웨어 (Noldus, 네덜란드)는 단일 및 복수 모두 파리의 비디오 추적 가능한 또 다른 강력한 방법입니다,하지만 그것은 단지 상용이며, 꽤 고가입니다.
당신이 추적 분석을 설정하고 안정적인 레코딩을 수없는 경우 고려해야 할 몇 가지있다. Circadian 리듬 문제는 종종 큰 문제입니다. 행동 assays를 실행하는 경우, 하나는 항상 정오 시에스타 동안 파리를 실행하지 않도록해야합니다. 우리는 curre 때문에ntly 전위의 행동 감소를 생성할 수 있습니다 유전자에 관심을, 우리는 늦은 오후 활동 피크 (ZT 8-10) 근처에 파리를 실행하는 것을 선호합니다. 또 다른 문제는 또한 소스에서 일관성 공기 흐름에서 발생할 수 있습니다. 시작 시도하기 전에, 그것은 15초 공기 펄스를 통해 크게 변동되지 않도록 즉, 유량계와 공기 흐름을 테스트해야합니다. 마지막으로, 유전 배경은 모든 행동 작업에서 역할을 할 수 있으므로,이 분석의 매개 변수 중 일부는 특정 배경 최적화해야 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 LC 그리피스에게 수여 보건 부여 R01 GM54408 국립 연구소에 의해 지원되었다. 우리는 광장 챔버 설계 및 실내 건축 및 분석 문제에 대해 도움이 대화를 댄 발렌테 및 팀 Lebestky에 대한 브랜다 이스 대학 기계 공장에서 우리의 분석, 프랭크 멜로를 설정하는 모든 도움 프레드 울프 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
