Summary
复杂的运动器官的行为在研究
Abstract
苍蝇提供了一个复杂的行为，由于在这一领域的研究人员提供的遗传工具的大量研究的重要模式。在学习的运动行为
Protocol
第1部分：苍蝇的饲养和管理
- 苍蝇应该是生长在含有酵母的标准媒体瓶。您将需要大量的苍蝇，所以需要设立相应的十字架。苍蝇应在25℃生长在一个12小时的光：暗周期
- 苍蝇应收集羽化后不久（1-3天）。苍蝇可与使用二氧化碳扩散的阶段，并应包含蒸压或酵母媒体的测试管排序。我们使用雄性10只，存储到试管中。
- 允许使用二氧化碳后运行行为实验前至少一天或两天。我们运行我们的行为实验中的苍蝇以下羽化3-5天。
- 检测应该总是做相同的2-3小时的时间窗口每一天内，以避免昼夜节律问题。
第2部分：设置在受控环境中的跟踪系统
- 所有的实验都保持一个恒定温度25 º C，湿度70％的环境中，房间。
- 暂停对该地区的数码摄像机要记录（摄像机朝下）。由于我们的跟踪软件为基础的对比，我们会暂停灯箱相机。相机记录影片直接到戴尔电脑通过FireWire连接。我们使用了夏普的数字视频摄像机，视频采集挂接到一个使用Windows MovieMaker的戴尔计算机（Vista版本）。
- 空气脉冲将在这个协议管理，使空气流动的来源，必须在房间里。使用橡胶管连接气源为空气过滤器活性炭过滤器。
- 使用更多的橡胶管，连接另一端的碳过滤器，通过一个中空的橡胶塞锥形瓶中，并填写烧瓶中，约半英寸的水。这将湿润的空气。
- 烧瓶，也应该有一个手枪，这将连接到一个Y形阀，通过橡皮管。
- Y型阀的一个分支应该被连接到一个流量计。其他部门应提供空气平方米的运动室。
第3部分：运动室提供苍蝇
- 平方米的运动室Wolf 等人设计的基础上从2002 年 1，小降盘此外，商会内的飞行，以防止苍蝇。商会应采取外，应彻底消灭所有的组件，用70％乙醇和使用前干燥。
- 麻醉前，立即进行行为检测可能妥协的性能。为了避免这种情况，苍蝇轻轻敲成一个小插座使用一个漏斗分。为了让大小合适的插座，附加一个蓝色的枪头（P1000）的一个漏斗年底。用剪刀切断枪头的，开放的大飞通过足够。
- 我们的房间的顶部是一个小块有机玻璃边缘周围的螺丝固定。被删除，当螺丝孔，可用于提供苍蝇进入会议厅。有机玻璃顶部的螺丝孔，以便直接在位于内宅，而不是一个螺丝钉的位置一般位于的位置。试管中含有的苍蝇，放在倒置的漏斗，然后应放置到螺丝孔。
- 不要移动漏斗，因为这可能伤害或损坏的苍蝇。相反，轻轻的一声整个腔，漏斗和所有，直到所有的苍蝇箱内。这敲应该做的鼠标垫，吸收这一撞冲击。当苍蝇在里面，取出漏斗，重新定位的螺丝床有机玻璃顶部。然后重新拧入地方有机玻璃顶部。
第4部分：跑步运动检测
- 一旦苍蝇正确加载，让他们适应环境在30分钟的会议厅举行会议。这驯化期间，应采取在控制的环境中（25 ° C，湿度70％），和室应放在灯箱上（应打开）。关闭其他房间的灯熄灭。
- 驯化期间，Y型阀开关在空气流通系统，如空气流量计只会流。打开空气，坡道空气所需的速度（4.0-6.0升/分钟）。我们一般使用5.0-5.5升/分钟，但在这个范围内的任何速度会的工作。
- 一旦达到所需的空速，Y型阀切换，使空气流动的运动室。时间为15秒的空气脉冲，然后突然打开空气。当您打开空气开关的相机记录模式。 （这部分需要练习做一次）。
- 所需的时间后停止录音并保存。我们记录每秒10帧（至少8个基因型试验），30秒的试验。
第5部分：视频分析
- 我们使用动态图像分析系统（DIAS）3.2软件议案追踪2。为了使用这种软件，我们首先我们的视频转换成AVI文件格式的QuickTime 7.5.5。
- 要跟踪对比的基础苍蝇，我们使用“阈值自动跟踪”功能。然后，我们使用“设为路径从跟踪”功能的数字化这些痕迹。
- 每个飞输出的瞬时速度，我们使用“计算参数”的功能，产生一个数据库文件（DIAS特定）。使用此功能，我们也能顺利使用“5,15,60,15,5”杜克平滑窗口的数据。
- 一旦这个信息是作为一个数据库文件的输出，它可以打开在Microsoft Excel中。我们使用MATLAB脚本来编译Excel内的瞬时速度，并计算为了解运动动态和布特结构所需的额外参数。
代表性的成果：
图1显示了从野生型广小号生物体（图1，左侧面板）的代表痕迹和苍蝇 dCASK基因，其中跨越了两个大的重叠缺失（DF（3R）X307和DF（3R）x313）（图1生成的空右图）。dCASK空苍蝇先前已被证明有使用布里丹的范式3的运动问题，并在我们的范例，广小号相比，他们表现出大大减少运动。我们始终运行野生型生物，以确保正常范围内的某一天，条件和行为。我们已经看到在不到5天的测试，偏离标准的反应。这些差异通常可以归结为我们的受控环境中的参数问题。
图1。DIAS的产生既广小号野生型果蝇（上，左）和运动能力缺陷dCASK空苍蝇重叠缺失（上，右）所产生的痕迹。什么是录制的影片中看到的痕迹代表。图文并茂contrain 8-10苍蝇的痕迹在视频跟踪检测，30秒以下的空气脉冲运行。
图2野生型果蝇的运动检测（以上），下面的空气脉冲（紫酒吧）和没有空气脉冲（蓝色）运行。在分析程序中计算所有参数，有两个条件之间没有显着差异（双尾学生t检验确定）。这表明，空气脉冲，苍蝇locomote通常在我们的设置。
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Discussion
在我们的设置，一个中等强度的空气脉冲瞬时停止飞行运动。当空气脉冲结束时，苍蝇被释放这种静止状态和locomote通常，如在图2所示。因为这空气脉冲可有效地同步运动的人口，我们用它来开始审判，因此，我们也可以研究运动的发病势头打破刺激。然而，该试剂盒可以做没有空气脉冲自启动后的运动参数是由空气脉冲（图2）的影响。
一个经常发生的问题与运动自动分析看到的碰撞问题。跟踪计划的大部分在处理与苍蝇，碰撞出了名的坏。这些方案往往失去一个对象的“视线”瞬间碰撞时，发现一个新的对象这个对象标签。结果可以输出，有更多的追查对象比实际存在，在会议厅内。许多人为了解决这个问题，跟踪单苍蝇。然而，这个明显的问题是，单一的飞行行为可能是由于社会线索的作用在果蝇的行为和运动4比人口的行为非常不同。 ，当然，这未必是一件坏事，取决于你正在尝试研究，但我们的目的，我们更倾向于使用苍蝇的人群，以提高我们的统计能力。正因为如此，我们处理两种方式的碰撞。首先，我们只用8-10％的苍蝇（56毫米平方室）审判，使碰撞将微乎其微。其次，在我们30的第二个试验中，我们只分析长度至少18秒的痕迹。这样一来，我们一直在记录足够的时间来捕捉他们的整个运动的多重较量。这也确保了我们的样本大小总是反映的苍蝇在一腔，为更小的片段的议案被丢弃的视频的总长度只有30秒。
数据分析，可以在这整个过程中最困难的部分。跟踪数据的分析，最重要的一步是确定的噪音和运动之间的区别。 DIAS（像其他许多项目）几乎不会输出0毫米/秒的速度，即使飞停止移动。正因为如此，它是重要的数据输出帧一帧时看到的生物体实际上是在运动的同时，观看视频，而当他们不。在我们的设置，低于1 mm的/ s的速度似乎是噪音，这是与其他团体使用DIAS发现成蝇1一致。对于回合结构的动态，还需要定义一个回合。我们定义为3个或更多的连续帧的速度，高于1毫米/秒，而闲置低于此阈值的3个或更多的连续帧的活动。
的数据也必须妥善平滑，以消除瞬态光闪烁，摄像头扭曲，偶尔会出现的文物。有没有数据平滑的标准方法，但重要的是，平滑过程中不改变数据的总的趋势太大幅度，或可以产生平滑的工件。与杜克窗口“5,15,60,15,5”我们顺利的两倍，因为它似乎消除任何大的跳跃或速度的变化，显然是错误的的，但不会改变总体趋势或数据的性质。
重要的是要认识到不同的设置和环境会产生不同的行为结果。我们的建议，成立一个跟踪检测的人是所有这些问题的实验，直到找到一个方法，该方法产生的数据相匹配，可以肉眼看到，然后以同样的方式处理所有数据尽可能一致。
正确的跟踪方案的选择也很重要。虽然我们使用DIAS 3.2（www.solltechnologies.com），这决不是最好的或唯一的系统可用。对于跟踪单苍蝇，丹瓦伦特（米特拉实验室，冷泉港实验室）开发Ftrack程序。对于多个苍蝇一起locomoting（即可能会发生碰撞），克里斯汀布兰森（迪金森/佩罗娜实验室，加州理工学院）开发了所谓Ctrax程序。 Ftrack是在www.chronux.org，而Ctrax www.dickinson.caltech.edu /研究/ Mtrax。 Ethovision软件（Noldus荷兰）是另一个强大的功能，可用于单个和多个苍蝇的视频跟踪，但它是市面上唯一的，而且是相当昂贵的。
如果您已设置了跟踪检测，并不能得到可靠的录音，有几件事情要考虑。昼夜节律的问题往往是一个大问题。运行时行为分析，应始终确保不运行期间，中午午睡的苍蝇。由于我们是currently在基因可产生的运动行为减少有兴趣，我们宁愿运行近傍晚活动高峰期（ZT 8-10）的苍蝇。另一个问题也可能出现不一致的空气流动，从源头。在开始试验之前，一定要测试流量计的空气流动，所以它不会超过15秒的空气脉冲波动很大。最后，遗传背景，可以在所有的行为任务中发挥作用，所以这个实验中的参数可能需要为一个特定的背景优化。
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Acknowledgments
这项工作是由国家卫生部批准R01 GM54408授予立法会格里菲斯学院的支持。我们要感谢他对所有帮助我们的方腔设计和设置我们的实验中，弗兰克梅洛在布兰代斯大学的机加工车间建设我们的商会，丹瓦伦特和蒂姆Lebestky关于有助于分析问题的谈话弗雷德沃尔夫。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
