Summary
Lo studio del comportamento motorio complesso in
Abstract
Vola fornire un importante modello per lo studio del comportamento complesso a causa della pletora di strumenti genetici a disposizione dei ricercatori in questo campo. Studiare il comportamento motorio in
Protocol
Parte 1: alimentazione e gestione delle mosche
- Vola deve essere coltivata in flaconi contenenti lievito senza supporti standard. Avrete bisogno di un gran numero di mosche, così croci bisogno di essere impostato di conseguenza. Vola deve essere coltivate in una 12-ore di luce: buio ciclo a 25 ° C.
- Le mosche devono essere raccolti subito dopo eclosion (1-3 giorni). Le mosche possono essere lavorato in questa fase utilizzando un diffusore di anidride carbonica, e deve essere ordinato in provette contenenti i media autoclavati o senza lievito. Noi usiamo solo i maschi, 10 memorizzati in una provetta.
- Attendere almeno un giorno o due dopo l'uso di anidride carbonica prima di eseguire gli esperimenti comportamentali. Corriamo vola nei nostri test comportamentali 3-5 giorni dopo Eclosion.
- Test deve essere sempre effettuata all'interno della stessa finestra 2-3 ore di tempo ogni giorno per evitare problemi di ritmo circadiano.
Parte 2: Installazione del sistema di tracciamento in un ambiente controllato
- Tutti gli esperimenti sono fatti in una stanza ambiente che mantiene una temperatura costante di 25 º C con il 70% di umidità.
- Sospendere una videocamera digitale sopra l'area da registrare (telecamera rivolta verso il basso). Poiché il nostro software di monitoraggio è invece basato, sospendiamo la fotocamera su un light box. La fotocamera registra video direttamente su un computer Dell tramite una connessione firewire. Noi usiamo una fotocamera Sharp video digitale, collegato ad un computer Dell con Windows Moviemaker (versione Vista) per l'acquisizione video.
- Impulsi di aria sarà somministrato in questo protocollo, quindi una fonte di flusso d'aria deve essere presente nella stanza. Utilizzando un tubo in gomma, collegare la sorgente d'aria per un filtro a carbone per la filtrazione dell'aria.
- Utilizzando un tubo in gomma di più, collegare l'altro lato del filtro a carbone per una beuta attraverso un tappo di gomma vuota, e riempire il pallone con circa un centimetro e mezzo d'acqua. Questo umidificare l'aria.
- Il pallone deve anche avere un arma da fianco, che si collegherà a forma di Y valvola tramite tubi in gomma.
- Un ramo della Y-valvola deve essere collegato ad un misuratore di portata. L'altro ramo deve fornire aria alla camera di locomozione piazza.
Parte 3: dare vola alla camera di locomozione
- La camera di locomozione piazza è basato sul design di Wolf et al. 2002 1, con l'aggiunta di vassoi piccola goccia per evitare che le mosche di volare all'interno della camera. La camera deve essere smontato, e tutti i componenti devono essere accuratamente pulito con etanolo al 70% e asciugato prima dell'uso.
- Anestesia immediatamente prima di effettuare un test comportamentale può potenzialmente compromettere le prestazioni. Per evitare questo, le mosche sono delicatamente bussato nella camera usando un imbuto con una presa di piccole dimensioni. Per fare una presa della misura giusta, allegare una punta blu pipetta (per P1000) alla fine di un imbuto. Usare le forbici per tagliare la fine del puntale per rendere l'apertura abbastanza grande per una mosca a passare attraverso.
- La parte superiore della nostra camera è un piccolo pezzo di plexiglass avvitato intorno ai bordi. Quando le viti vengono rimosse, i fori possono essere usati per fornire vola nella camera. Posizionare la parte superiore in plexiglass in modo che il foro della vite si trova direttamente sopra la camera interna al posto di una vite in cui si trova normalmente. Prendere una provetta contenente le mosche e metterlo a testa in giù sopra l'imbuto, che dovrebbe poi essere inserito nel foro della vite.
- Non spostare l'imbuto, in quanto ciò potrebbe ferire o danneggiare le mosche. Invece, dolcemente botto tutta la camera, imbuto e tutti, fino a che tutte le mosche sono all'interno della camera. Questo bussare dovrebbe essere fatto su un tappetino mouse per assorbire lo shock di questa sbattere. Quando le mosche sono all'interno, togliere l'imbuto, e riposizionare la parte superiore in plexiglass sopra i letti vite. Poi ri-avvitare la parte superiore in plexiglass in posizione.
Parte 4: Esecuzione del saggio locomotore
- Una volta che le mosche vengono caricati correttamente, far loro ambientarsi nella camera per 30 minuti. Questo periodo di acclimatazione deve avvenire in ambiente controllato (25 ° C, 70% di umidità), e la camera deve essere posto in cima al light box (che dovrebbe essere acceso). Accendere le luci stanza off.
- Dopo il periodo di acclimatazione, passare la Y-valvola nel sistema di flusso d'aria in modo che il flusso d'aria solo per il misuratore di portata. Accendere l'aria, l'aria e la rampa fino alla velocità desiderata (4,0-6,0 L / min). Generalmente usiamo 5,0-5,5 L / min, ma qualsiasi velocità in tale intervallo funzionerà.
- Una volta che la velocità desiderata è raggiunta, l'interruttore Y-valvola in modo che l'aria fluisce verso la camera di locomozione. Tempo questo impulso d'aria per 15 secondi, e poi girare bruscamente l'aria spenta. Come si accende l'aria spenta, accendere la fotocamera per registrare modalità. (Questa parte vuole pratica di fare tutto in una volta).
- Interrompere la registrazione dopo il tempo desiderato e SAVE. Registriamo 30 prove secondo a 10 fotogrammi al secondo (almeno 8 prove per genotipo).
Parte 5: Analisi dei Video
- Usiamo ilAnalisi dinamica del sistema di immagine (DIAS) 3.2 per il software di motion tracking 2. Per poter utilizzare questo software, che prima convertire i nostri video in un formato di file AVI con QuickTime 7.5.5.
- Per tracciare le mosche in base al contrasto, si usa il "AutoTrace da Threshold" funzione. Siamo quindi utilizzare il "Crea tracciato da traccia" funzione di digitalizzare queste tracce.
- Per emettere la velocità istantanea di ogni volo, si usa il "Compute Parametri" funzione di produrre un file di database (DIAS-specifico). Con questa funzione, abbiamo anche liscia i dati utilizzando un "5,15,60,15,5" Tukey Finestra levigante.
- Una volta che questa informazione è fornito come un file di database, può essere aperto in Microsoft Excel. Noi usiamo uno script Matlab per compilare la velocità istantanea all'interno di eccellere e di calcolare i parametri aggiuntivi necessari per comprendere la dinamica del movimento e la struttura incontro.
Rappresentante dei risultati:
La figura 1 mostra tracce rappresentante di organismi selvatici tipo Canton S (Figura 1, pannello a sinistra) e vola nullo per il gene dCASK cui sono stati generati dall'incrocio di due grandi delezioni sovrapposte (Df (3R) X307 e Df (3R) X313) (Figura 1 , a destra del pannello). mosche nullo dCASK precedentemente dimostrato di avere problemi locomotori con Paradigma di Buridano 3, e nel nostro paradigma, rispetto al Canton S, mostrano notevolmente ridotta locomozione. Abbiamo sempre gestito organismi wild-type prima per assicurarsi che le condizioni e il comportamento sono all'interno del range di normalità in un dato giorno. Abbiamo osservato deviazioni dalle risposte standard in meno del 5% dei giorni di test. Queste differenze di solito possono essere attribuiti a problemi con i parametri del nostro ambiente controllato.
Figura 1. DIAS generati tracce di entrambe le mosche Canton S wild-type (sopra, a sinistra) e Locomotore-deficienti Null dCASK vola generato da cancellature sovrapposte (sopra, a destra). Le tracce rappresentano ciò che si vede nel video registrati. Entrambe le tracce controindicazione immagini 8-10 vola per 30 secondi nel test di monitoraggio video che segue un impulso d'aria.
Figura 2. Vola tipo selvaggio sono stati eseguiti nel test locomotore (sopra) in seguito ad un impulso di aria (barre viola) e senza un impulso d'aria (blu). In tutti i parametri calcolati dal programma di analisi, non vi erano differenze significative tra le due condizioni (determinato con due code studenti t-test). Questo dimostra che in seguito ad un impulso di aria, vola locomote normalmente nel nostro setup.
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Discussion
Nella nostra impostazione, un impulso di aria moderatamente forte movimento si arresta temporaneamente volare. Quando l'aria pulsata termina, le mosche vengono rilasciati da questo stato stazionario e locomote normalmente, come mostrato in figura 2. Perché questo impulso di aria sincronizza in modo efficace locomozione della popolazione, lo usiamo per cominciare il processo in modo da poter anche studiare l'insorgenza del movimento a seguito di un momento di rottura stimolo. Il test può comunque essere fatto senza un impulso d'aria in quanto i parametri locomotore dopo l'inizio non sono influenzate dagli impulsi d'aria (Figura 2).
Un problema frequente visto con l'analisi automatizzata di locomozione è la questione di collisioni. Programmi di tracking sono per la maggior parte notoriamente incapaci di trattare con le mosche che si scontrano. Questi programmi spesso perdere di "vista" di un oggetto momentaneamente durante una collisione, e su questa etichetta trovando oggetto come un nuovo oggetto. Il risultato può essere una potenza che ha molti oggetti più tracciati che effettivamente esistono in camera. Molte persone risolvere questo problema tracciando vola sola. Il problema evidente con questo, però, è che il comportamento mosca può essere molto differente dal comportamento di popolazione a causa del ruolo di segnali sociali nel comportamento Drosophila e locomozione 4. Questo è, ovviamente, non necessariamente una cosa negativa, a seconda di ciò che si sta cercando di studiare, ma per i nostri scopi, preferiamo usare le popolazioni di mosche per aumentare la nostra potenza statistica. A causa di questo, ci occupiamo di collisioni in due modi. In primo luogo, usiamo solo 8-10 vola al processo (nel nostro 56 millimetri quadrati da camera), in modo che le collisioni sarà minimo. In secondo luogo, entro nostra trentennale prove secondo, abbiamo solo analizzare le tracce che hanno almeno 18 secondi di lunghezza. In questo modo, siamo sempre tempo di registrazione sufficiente a catturare attacchi multipli di movimento nella loro interezza. Questo assicura anche che il nostro campione riflette sempre il numero di mosche in una camera, come piccoli frammenti di movimento vengono scartati e la lunghezza totale del video è di soli 30 secondi.
L'analisi dei dati può essere la parte più difficile di tutto questo processo. Il passo più importante di analizzare i dati di monitoraggio è quello di determinare la differenza tra il rumore e movimento. DIAS (come molti altri programmi) sarà quasi mai uscita una velocità pari a 0 mm / s, anche se il volo ha smesso di muoversi. Per questo motivo, è importante guardare i video guardando il frame di dati in uscita per fotogramma per vedere quando gli organismi sono in realtà in movimento, e quando non lo sono. Nella nostra impostazione, tutte le velocità inferiori a 1 mm / s sembra essere il rumore, che è coerente con quello che altri gruppi con DIAS hanno trovato con le mosche adulte 1. Per guardare le dinamiche della struttura di attacco, si deve anche definire un incontro. Si definiscono attività di 3 o più fotogrammi consecutivi di velocità superiori a 1 mm / s, e l'inattività, come 3 o più fotogrammi consecutivi al di sotto di questa soglia.
I dati devono essere adeguatamente lisciato per eliminare gli artefatti da tremolante luce transitoria e le distorsioni della fotocamera, che di tanto in tanto si verificano. Non esiste un metodo standard per i dati smoothing, ma è importante che il processo di smoothing non cambia la tendenza generale dei dati troppo drasticamente, o si può generare artefatti lisciatura. Noi liscio due volte con una finestra di Tukey "5,15,60,15,5", perché sembra eliminare qualsiasi salti di grandi dimensioni o variazioni di velocità che sono chiaramente sbagliati, ma non cambia la tendenza generale o la natura dei dati.
E 'importante riconoscere che le configurazioni e ambienti diversi produrranno diversi risultati comportamentali. La nostra raccomandazione a chiunque la creazione di un test di rilevamento è quello di sperimentare con tutti questi problemi fino a trovare un metodo che produce dati che corrisponde a ciò che si vede visivamente, e quindi essere più coerente possibile nel trattamento di tutti i dati nello stesso modo.
Scelta del programma di monitoraggio a destra è anche importante. Anche se usiamo DIAS 3.2 (www.solltechnologies.com), questo non è affatto il migliore o l'unico sistema a disposizione. Per il monitoraggio di mosche singolo, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) ha sviluppato un programma chiamato FTrack. Per le mosche più locomoting insieme (cioè, in cui possono verificarsi collisioni), Kristin Branson (Dickinson / Labs Perona, Caltech) ha sviluppato un programma chiamato Ctrax. FTrack è disponibile presso www.chronux.org, mentre Ctrax è disponibile presso www.dickinson.caltech.edu / Ricerca / Mtrax. Ethovision software (Noldus, Paesi Bassi) è un'altra opzione potente a disposizione per il monitoraggio video di mosche sia singole e multiple, ma è solo disponibile in commercio, ed è piuttosto costoso.
Se hai impostato un test di tracciamento e non può ottenere registrazioni attendibili, ci sono alcune cose da considerare. Problemi di ritmo circadiano sono spesso un grosso problema. Durante l'esecuzione di analisi comportamentale, si dovrebbe sempre fare attenzione a non eseguire le mosche durante la siesta di mezzogiorno. Poiché siamo currently interessati nei geni che possono produrre diminuzioni comportamento locomotorio, preferiamo eseguire vola vicino al picco di attività tardo pomeriggio (ZT 8-10). Un altro problema può derivare anche da flusso d'aria incoerente dalla sorgente. Prima dell'inizio delle prove di iniziare, assicurarsi di testare il flusso d'aria con il misuratore di portata, in modo che non sarà soggetto a forti fluttuazioni nel corso degli impulsi di aria 15 secondi. Infine, background genetico può giocare un ruolo in tutte le attività comportamentali, per cui alcuni dei parametri di questo test potrebbero dover essere ottimizzato per un fondo particolare.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01 GM54408 assegnato a LC Griffith. Vorremmo ringraziare Fred Wolf per il suo aiuto nel progettare la nostra camera di piazza e la creazione di nostri test, Frank Mello alla macchina negozio Brandeis University per costruire la nostra camera, e Dan Valente e Tim Lebestky per le conversazioni utili per quanto riguarda questioni di analisi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
