Summary
El estudio del comportamiento complejo en el aparato locomotor
Abstract
Las moscas proporcionar un importante modelo para estudiar el comportamiento complejo debido a la gran cantidad de herramientas genéticas disponibles para los investigadores en este campo. Estudiar el comportamiento del aparato locomotor en
Protocol
Parte 1: alimentación y manejo de las moscas
- Las moscas deben ser cultivadas en frascos de levadura libre de los medios de comunicación estándar. Usted necesitará un gran número de moscas, por lo que cruza es necesario establecer en consecuencia. Las moscas deben ser cultivadas en un 12 horas de luz: oscuridad ciclo a 25 º C.
- Las moscas deben ser recogidos poco después de la eclosión (1-3 días). Las moscas pueden ser trabajado en esta etapa con un difusor de dióxido de carbono, y deben ser ordenados en tubos de ensayo que contiene los medios de comunicación en autoclave o sin levadura. Utilizamos sólo los machos, almacena 10 a un tubo de ensayo.
- Deje por lo menos un día o dos después de su uso de dióxido de carbono antes de ejecutar los experimentos de comportamiento. Se corre vuela en nuestro ensayo de comportamiento de 3-5 días después de la eclosión.
- Los ensayos se debe hacer siempre en la misma ventana de tiempo de 2-3 horas cada día para evitar problemas de ritmo circadiano.
Parte 2: Configuración del sistema de seguimiento en un ambiente controlado
- Todos los experimentos se hacen en una sala de medio ambiente que mantiene una temperatura constante de 25 º C con una humedad del 70%.
- Suspender una cámara de vídeo digital sobre la zona a grabar (la cámara hacia abajo). Desde nuestro software de seguimiento basado en un contraste, se suspenderá la cámara a través de una caja de luz. La cámara graba vídeos directamente en un ordenador Dell a través de una conexión FireWire. Usamos una cámara de vídeo digital de Sharp, conectado a una computadora Dell con Windows MovieMaker (versión de Vista) para la adquisición de video.
- Pulsos de aire será administrado en el presente Protocolo, por lo que una fuente de flujo de aire debe estar presente en la sala. Con mangueras de caucho, conecte la fuente de aire a un filtro de carbono para la filtración de aire.
- El uso de más tubos de goma, conecte el otro lado del filtro de carbón a un erlenmeyer a través de un tapón de goma hueco, y llenar el recipiente con aproximadamente media pulgada de agua. Esto humedecer el aire.
- El frasco debe también tener un arma, que se conectará a una válvula en forma de Y a través de un tubo de goma.
- Una rama de la Y de la válvula debe estar conectado a un medidor de caudal. La otra rama que suministra aire a la cámara de locomoción cuadrados.
Parte 3: Entrega de las moscas a la cámara de locomoción
- La cámara de locomoción cuadrados se basa en el diseño de Wolf et al. 2002 1, con la incorporación de bandejas de pequeña gota para evitar que las moscas que vuelan dentro de la cámara. La cámara debe ser desarmado, y todos los componentes deben ser cuidadosamente limpiados con etanol al 70% y se seca antes de su uso.
- Anestesia inmediatamente antes de la realización de un ensayo de comportamiento que podría comprometer el rendimiento. Para evitar esto, las moscas se golpeó suavemente en la cámara usando un embudo con una pequeña salida. Para hacer una salida del tamaño adecuado, colocar un azul punta de la pipeta (para P1000) hasta el final de un embudo. Utilice unas tijeras para cortar el extremo de la punta de la pipeta para hacer la abertura lo suficientemente grande como para volar a pasar.
- La parte superior de nuestra cámara es una pequeña pieza de plexiglás asegurada con tornillos en los bordes. Al retirar los tornillos, los agujeros pueden ser utilizados para presentar las moscas en la cámara. Coloque la parte superior de plexiglás, para que el agujero del tornillo se encuentra directamente sobre la cámara interior, en lugar de que un tornillo se encuentra normalmente. Tome un tubo de ensayo que contienen las moscas y colocarlo boca abajo sobre el embudo, el cual debe ser colocado en el agujero del tornillo.
- NO SE DEBE mover el embudo, ya que esto podría perjudicar o dañar a las moscas. En cambio, suavemente golpe toda la cámara, un embudo y todos, hasta que todas las moscas dentro de la cámara. Este golpear se debe hacer en una alfombrilla de ratón para absorber el impacto de esta golpeando. Cuando las moscas están en el interior, retire el embudo, y volver a colocar la tapa de plexiglás sobre las camas de tornillo. A continuación, volver a atornillar la tapa de plexiglás en su lugar.
Parte 4: Al realizar el análisis Locomotor
- Una vez que las moscas se han cargado correctamente, deje que se aclimate en la cámara durante 30 minutos. Este período de aclimatación debe tener lugar en el ambiente (25 º C, 70% de humedad), y la cámara debe ser colocado en la parte superior de la caja de luz (que debe estar encendido). Encienda las luces de sala de otros.
- Tras el período de aclimatación, el parámetro-y de la válvula en el sistema de flujo de aire de tal manera que el aire sólo el flujo del medidor de caudal. A su vez en el aire, y la rampa de aire hasta la velocidad deseada (4.0-6.0 L / min). Por lo general, el uso 5.0-5.5 L / min, pero cualquier velocidad en ese rango de trabajo.
- Una vez que la velocidad deseada se alcanza, el parámetro-y la válvula para que el aire fluye a la cámara de locomoción. Esta vez el aire de latidos durante 15 segundos, y luego, abruptamente, a su vez el flujo de aire. A medida que gira el aire apagado, conecte la cámara al modo de grabación. (Esta parte requiere de práctica para hacer todo a la vez).
- Detener la grabación después de la hora deseada y guardarla. Registramos 30 en segunda a 10 cuadros por segundo (al menos 8 ensayos por genotipo).
Parte 5: Análisis de Videos
- Usamos elImagen Sistema de Análisis Dinámico (DIAS) software 3.2 para el seguimiento del movimiento 2. Para poder utilizar este software, lo primero que convertir nuestros videos a un formato de archivo AVI con QuickTime 7.5.5.
- Para realizar el seguimiento de las moscas basado en el contraste, se utiliza el "Autotrace por Umbral" función. A continuación, utilizar el "Hacer trazado de Trace" función para digitalizar estas huellas.
- Para dar salida a la velocidad instantánea de cada vuelo, se utiliza el "Cálculo de los parámetros de" la función de producir un archivo de base de datos (DIAS específicos). Con esta función, también sin problemas los datos mediante un "5,15,60,15,5" Tukey ventana suavizado.
- Una vez que esta información es emitida como un archivo de base de datos, se puede abrir en Microsoft Excel. Nosotros usamos un script de Matlab para compilar la velocidad instantánea en Excel y calcular los parámetros adicionales necesarios para la comprensión de la dinámica del movimiento y la estructura de combate.
Los resultados representativos:
La figura 1 muestra las huellas representante de los organismos de tipo salvaje Cantón de S (Figura 1, panel izquierdo) y las moscas nulos para el gen dCASK que fueron generados por el cruce de dos grandes deleciones superpuestas (Df (3R) X307 y Df (3R) X313) (Figura 1 , panel derecho). moscas dCASK nulos han sido demostrado que tienen problemas del aparato locomotor utilizando paradigma de Buridán 3, y en nuestro paradigma, en comparación con el Cantón de S, que muestran gran disminución de la locomoción. La humanidad siempre corre organismos de tipo salvaje primero para asegurarse de que las condiciones y el comportamiento están dentro del rango normal en un día determinado. Hemos observado desviaciones estándar de las respuestas en menos de 5% de los días de prueba. Estas diferencias en general se puede atribuir a problemas con los parámetros de nuestro entorno controlado.
Figura 1. DIAS generado por las huellas de ambos Cantón S moscas de tipo salvaje (arriba, izquierda) y la locomotora con deficiencia de Null dCASK moscas generadas por las supresiones superposición (arriba, derecha). Las huellas representan lo que se ve en los vídeos grabados. Ambos rastros imágenes contraindicaciones 8-10 moscas funcionar durante 30 segundos en el ensayo de seguimiento de vídeo después de un pulso de aire.
Figura 2. Moscas de tipo silvestre se realizaron en el ensayo del aparato locomotor (arriba) después de un pulso de aire (barras moradas) y sin un impulso de aire (azul). En todos los parámetros calculados por el programa de análisis, no hubo diferencias significativas entre las dos condiciones (determinado con dos colas prueba t de Student). Esto demuestra que después de un impulso de aire, las moscas de locomoción normal en nuestra configuración.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En nuestra configuración, un impulso de aire moderadamente fuerte transitoriamente detiene el movimiento de volar. Cuando el pulso termina de aire, las moscas son liberados de este estado estacionario y moverse con normalidad, como se muestra en la figura 2. Debido a que este impulso de aire efectivamente se sincroniza la locomoción de la población, lo usamos para comenzar el juicio por lo que también podemos estudiar el inicio del movimiento después de un estímulo impulso sin precedentes. El ensayo puede, sin embargo, llevar a cabo sin un impulso de aire ya que los parámetros del aparato locomotor después del inicio no se ven afectados por el impulso de aire (Figura 2).
Uno de los problemas frecuentes observados con el análisis automatizado de locomoción es el problema de las colisiones. Programas de seguimiento están en su mayor parte notablemente malos para hacer frente a las moscas que entran en colisión. Estos programas a menudo pierden la "vista" de un objeto por un momento durante una colisión, y al encontrar esta etiqueta de objeto como un objeto nuevo. El resultado puede ser una salida que tiene muchos más objetos trazado que existen realmente en la cámara. Muchas personas a resolver este problema realizando el seguimiento moscas sola. El problema obvio con esto, sin embargo, es que el comportamiento sola mosca puede ser muy diferente al comportamiento de la población debido a la función de las señales sociales en el comportamiento de Drosophila y de la locomoción 4. Esto es, por supuesto, no es necesariamente algo malo, dependiendo de lo que está tratando de estudiar, pero para nuestros propósitos, preferimos utilizar las poblaciones de moscas para aumentar nuestro poder estadístico. Debido a esto, nos ocupamos de las colisiones de dos maneras. En primer lugar, sólo usamos 80-10 moscas por el juicio (en nuestra cámara de 56 mm ²), por lo que las colisiones será mínimo. En segundo lugar, dentro de los treinta en segunda, sólo se analizan las huellas que por lo menos 18 segundos de duración. De esta manera, siempre estamos registro de tiempo suficiente para capturar series múltiples de movimiento en su totalidad. Esto también garantiza que el tamaño de nuestra muestra refleja siempre el número de moscas en una cámara, como pequeños fragmentos de movimiento se descartan y la duración total del video es de sólo 30 segundos.
Análisis de los datos puede ser la parte más difícil de todo este proceso. El paso más importante de analizar los datos de seguimiento es determinar la diferencia entre el ruido y el movimiento. DIAS (al igual que muchos otros programas) casi nunca se dará salida a una velocidad de 0 mm / s, aunque la marcha ha dejado de moverse. Debido a esto, es importante ver los videos mientras se mira en el marco de la salida de datos por imagen para ver cuando los organismos son en realidad en movimiento, y cuando no lo son. En nuestra configuración, todas las velocidades por debajo de 1 mm / s parece que el ruido, lo cual es consistente con lo que otros grupos que usan DIAS han encontrado con una moscas adultas. Para analizar la dinámica de la estructura de combate, uno también tiene que definir una pelea. Se define la actividad como 3 o más imágenes consecutivas de la velocidad por encima de 1 mm / s, y la inactividad de 3 o más fotogramas consecutivos por debajo de este umbral.
Los datos también deben estar debidamente suavizadas para eliminar los artefactos de luz parpadeante transitoria y las distorsiones de la cámara, que en ocasiones se producen. No existe un método estándar para el suavizado de los datos, pero es importante que el proceso de alisado no cambia la tendencia general de los datos de forma demasiado drástica, o se puede generar artefactos de suavizado. Nos suave dos veces con una ventana de Tukey "5,15,60,15,5", porque parece eliminar cualquier grandes saltos o cambios de velocidad que son claramente erróneas, pero no cambia la tendencia general o la naturaleza de los datos.
Es importante reconocer que las diferentes configuraciones y entornos se producen diferentes resultados conductuales. Nuestra recomendación a todo el que cree un ensayo de seguimiento es experimentar con todas estas cuestiones hasta que encuentre un método que produce datos que coinciden con lo que se ve visualmente, a continuación, ser tan consistente como sea posible en el tratamiento de todos los datos de la misma manera.
Selección del programa de seguimiento de la derecha también es importante. A pesar de que el uso DIAS 3,2 (www.solltechnologies.com), este no es el mejor o el único sistema disponible. Para el seguimiento de las moscas de un solo, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) ha desarrollado un programa llamado FTrack. Para las moscas de múltiples locomoción juntos (es decir, donde las colisiones pueden ocurrir), Kristin Branson (Dickinson / Labs Perona, Caltech) ha desarrollado un programa llamado Ctrax. FTrack está disponible en www.chronux.org, mientras que Ctrax está disponible en www.dickinson.caltech.edu / Investigación / Mtrax. Ethovision software (Noldus, Países Bajos) es otra opción de gran alcance para el seguimiento de vídeo de moscas tanto individuales como múltiples, pero es sólo disponible en el mercado, y es bastante caro.
Si ha establecido un ensayo de seguimiento y no se pueden hacer grabaciones fiables, hay algunas cosas a tener en cuenta. Problemas del ritmo circadiano son a menudo un gran problema. Cuando se ejecuta ensayos de comportamiento, uno siempre debe asegurarse de no correr vuela durante su siesta de mediodía. Ya que estamos currently interesados en los genes que pueden producir disminución en el comportamiento del aparato locomotor, que prefieren correr vuela cerca del pico de la tarde la actividad de tarde (ZT 80-10). Otro problema también puede surgir de un flujo de aire inconsistente de la fuente. Antes de comenzar los ensayos, asegúrese de probar el flujo de aire con el medidor de flujo, por lo que no va a variar en gran medida sobre el pulso de aire de 15 segundos. Por último, los antecedentes genéticos pueden desempeñar un papel en todas las tareas de comportamiento, por lo que algunos de los parámetros de este ensayo puede ser necesario para ser optimizado para un fondo en particular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Grant R01 GM54408 otorgado a LC Griffith. Nos gustaría agradecer a Fred Wolf por toda su ayuda en el diseño de nuestra cámara cuadrada y la creación de nuestro ensayo, Frank Mello en el taller de máquinas para la construcción de la Universidad de Brandeis nuestra cámara, y Dan Valente y Lebestky Tim para las conversaciones útiles con respecto a temas de análisis.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
