Summary
نحن هنا وصف أساليب الكهربية لقياس انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية لليرقة ذبابة الفاكهة. أثار إطلاق سراح يبدأ بشكل مصطنع من خلال تحفيز الخلايا العصبية الحركية المحاور ، ويمكن قياسها من خلال انتقال NMJ التي أثارت استجابة بعد المشبكي في العضلات.
Abstract
في هذا الفيديو ، ونحن تصف الأساليب الكهربية لتسجيل انتقال متشابك عند تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) من يرقات ذبابة الفاكهة. الجهاز العصبي العضلي اليرقات هو المشبك نموذج لدراسة علم وظائف الأعضاء متشابك والعصبي ، ويشكل أداة للبحث القيم الذي عرف علم الوراثة ، ويمكن الوصول إلى التلاعب التجريبية. يمكن تشريح اليرقات لفضح الجدار العضلي الجسم والجهاز العصبي المركزي والأعصاب الطرفية. تتميز عضلات ذبابة الفاكهة ونمطها تعصيب العضلات بشكل جيد ويسهل الوصول لتسجيل داخل الخلايا. يمكن التعرف على العضلات الفردية عن طريق موقعهم والتوجيه داخل البطن 8 قطاعات ، ولكل منها 30 مرتبة في عضلات نمطا يتكرر في قطاعات A2 -- A7. يمكن تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات عضلات رقيقة والفردية وحزم من المحاور العصبية المحركة التي يمكن تصور تضوء
Protocol
قبل البدء في التحضير :
- تجول yhird يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي
- HL3.1 (التعديل الدملمف الشبيهة) حل
- لوحات Sylgard تشريح (شفاف المطاط سيليكون) الذي أعد في الصغيرة (35 × 10 ملم) أطباق بتري البلاستيكية باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) 3.
- دبابيس قطع تشريح قصيرة
- ماصات تحفيز كهربائي
- ماصات تسجيل حادة
HL3 الحل :
- خلال التشريح والتجارب الكهربية ، مغمورة في اليرقة HL3.1 الحل الذي يحتوي على 2 (مم) : 70 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 4 MgCl 2 ، 10 NaHCO 3 و 5 طرهالوز ، 115 السكروز ، وHEPES 5 ، ودرجة الحموضة 7.2.
- وأضاف تركيزات CaCl 2 إلى حل HL3.1 لتوفير تركيز الكالسيوم المطلوبة من خارج الخلية 2 +.
- يتم إجراء تشريح اليرقات في كا 2 + تركيزات منخفضة (لتجنب تقلص العضلات) باستخدام HL3.1 + 0.25 ملي CaCl 2 ، يحرص على الجليد.
- تسجل عادة في التجارب الكهربية HL3.1 + 1 ملم CaCl 2 ، ولكن يمكن تعديل هذا 0،4-1 ملي كا 2 + على النحو المطلوب.
- غير معقمة تصفية حل HL3.1 قبل الاستخدام ، وتخزينها في 4 ˚ جيم
إعداد وتحفيز تسجيل ماصات :
- يتم سحب تسجيل وتحفيز ماصات مع P - 2000 سوتر مجتذب micropipette الليزر القائمة على استخدام الإعدادات التالية : الحرارة = 390 ، الشعيرة = 4 = 35 السرعة ، والتأخر = 200 واسحب = 0.
- وتعد من أقطاب تحفيز رقيقة الجدران الزجاجية البورسليكات الشعيرات الدموية مع نهايات الواسعة التي كانت أكبر قليلا من عرض محاور المحركات قطعت. وfirepolished ينتهي على شكل لإعطاء الانتهاء من سلس (باستخدام ماصة Narashiga ملمع) ، للحد من الأضرار التي لحقت العصبية. تمتلئ تحفيز كهربائي مع الحل حمام (HL3.1 + 1 ملم كا 2 +).
- مستعدون الأقطاب تسجيل من الزجاج البورسليكات 1.2mm ، والتي يتم سحبها لتشكيل ماصة حادة (30-60 mΩ) ، ومليئة بوكل 3M.
الجزء 1 : يرقات ذبابة الفاكهة تشريح
- يتم تشريح الثالثة طور مرحلي اليرقات تجول لفضح العضلات في جدار الجسم كما هو موضح سابقا 4.
- يتم إجراء التشريح في HL3.1 + 0.25 ملي كا 2 + على لوحات صغيرة من السيليكون (35 × 10 ملم). يجب أن يكون الحل HL3.1 الجليد الباردة للتشريح من أجل تخدير اليرقة ، ويتم الاحتفاظ بها على الثلج قبل وأثناء تشريح.
- يتم تشريح اليرقات باستخدام الأساليب التي وصفها برنت ومكابي (2008) ، وهذا هو تعديل للتجارب الكهربية بإضافة 0.25 ملي كا 2 + في حل تشريح HL3.1 ، واستخدام الدبابيس تشريح قصيرة (~ 2 مم في الطول) التي هي أقل من المرجح أن تصل إلى الهدف المجهر والأقطاب الكهربائية خلال التجربة.
- بعد التشريح ، وقطعت محاور المحرك من اليرقات. يتم ذلك من خلال عقد مجلس الامن القومى برفق ورفعه قليلا بحيث يمكن قطع الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات الخلفية للالعقدة بطني دون الإضرار العضلات (الشكل 1). ثم تتم إزالة المخ.
- يتم غسلها إعداد اليرقات تشريح مرتين مع HL3.1 + 1 ملم كا 2 +.
الشكل 1. تخطيطي يبين الخطوات المتبعة في قطع السيارات من المحاور اليرقات تشريح. رفع الجهاز العصبي المركزي مع ملقط وتقطع المحاور الحركية في قاعدة الدماغ.
الجزء 2 : تسجيلات بين الخلايا من خلايا العضلات اليرقات.
- وضع لوحة على تشريح المجهر الكهربية وغمر الإعدادية مع HL3.1 + 1.5 ملي كا 2 + والإصلاح القطب حمام بحيث يكون على تماس مع الحل.
- وتجرى تجارب على جميع العضلات في غضون 6 الجزء البطن الثالثة (A3). يتم تحفيز الأعصاب الطرفية التي يعصب العضلات باستخدام الشفط الكهربائي 5.
- موقف القطب تحفيز في أول طبق لتجنب الاهتزازات عند القطب الخلايا في مكان. مكان القطب في تحفيز منطقة قريبة من الخلايا العصبية الحركية في العضلات 6 التعصيب وتطبيق طيف الامتصاص حتى يتم قطع العصب داخل ماصة الزجاج. يجب الحرص على عدم امتداد الأعصاب عند تطبيق الشفط. رفع ماصة قليلا حتى لا يكون لمس العضلات وضعه حتى لا يكون سحب على قطع الألياف العصبية (الشكل 2).
الشكل 2. تخطيطي للعضلات والخلايا العصبية الحركية التعصيب من جزء واحد في البطن من يرقة ذبابة الفاكهة. ويوضح موقف ماصة تحفيز الأعصاب وقطعت والقطب في تسجيل موقف في العضلات 6. - البينيةوالتسجيلات الخليوي مع microelectrodes حادة مليئة بوكل م 3. موقف القطب تسجيل فوق مركز للعضلة 6 على قطعة البطن الثالثة (A3) وضبط مدخلات يقابل ذلك فإنه يقرأ صفر من أجل حل الحمام. انخفاض ببطء الكهربائي ونهج العضلات تحت التكبير البصرية عالية حتى يلمس سطح العضلات. مشاهدة الذبذبات لتأكيد أنه تم اخترقت العضلات. ينبغي أن يستريح غشاء المحتملة على الأقل -60 بالسيارات ، أو لا ينبغي أن يكون استخدام الحيوانات. ينبغي متفرقة امكانات endplate مصغرة تكون الآن مرئية. ترك الخلية لتحقيق الاستقرار في لدقيقة واحدة قبل البدء في المحضر.
- تم الكشف عن التغييرات المحتملة في الغشاء مع رئيس أكسون المرحلة HS - 2A و 2B Axoclamp مكبر للصوت وسجلت مع v Clampex 8.2.0.235 (أكسون الآلات). و2B Axoclamp هو ربطه إلى الكمبيوتر الذي يدير برنامج pCLAMP ويعمل جنبا إلى جنب مع واجهة 1322A Digidata.
- وسجلت الخلايا لمدة 3 دقائق من دون أي مؤثرات لقياس ردود mEJP. وقد تم تحليل آثار البسيطة باستخدام برامج التحليل (Synaptosoft ، والخامس 6.0.3) والسعة والتردد mEJP تحديدها.
تحفيز العصب :
- ويتم تحفيز نهاية المقطوعة من الخلايا العصبية الحركية مع سلسلة من نبضات الجهد مربع (0.3 مللي ثانية مدتها) على كثافة غير كافية لكل من المحاور الحركية ، لتستثير استجابات متسقة في العضلات كلها.
- يتم إنشاء التحفيز مع ماجستير - 8 مولد النبض ، وهو مبرمج لتوصيل نبضات مستمرة وفقا للمدة والأوقات الفاصلة.
- سماح لمدة خمس ثوان بين المحفزات لتحقيق الانتعاش في NMJ متشابك.
- عند تحديد قوة الحافز ، وتبدأ مع أدنى مستوى لها ، وزيادة كثافة ببطء على مدى عدة محاكمات. وينبغي أن تستخدم لشدة التحفيز النتائج في الحد الأدنى الذي أثار رد فعل في التجارب.
- عندما يتم التوصل إلى شدة الحوافز المناسبة ، ينبغي أن يكون هناك واحد EJP مجمع واحد تقلص العضلات التي حركها التحفيز.
- سجل ما لا يقل عن 10 من كل الامكانيات أثار العضلات وسعة المتوسط.
الجزء 3 : النتائج الممثل
الشكل 3. تسجيل الخلايا العضلية من الممثل 6 تبين أثار EJP هو استجابة لالتحفيز الكهربائي للعصب قطعي ، وإمكانات متفرقة endplate مصغرة ، أو لmEJP. EJP في العضلات سعة 6 من اليرقات من النوع البري صحية ، مثل S كانتون ، وعادة ما تكون حوالي 40 فولت وسعة mEJP بين بالسيارات 1-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت وسائل هنا توفر طريقة سريعة نسبيا واسعة للكشف عن تغيرات في وظيفة متشابك في NMJ. القدرة على أداء التسجيلات الكهربية باستخدام حيوانات سليمة في الجسم الحي ، وتأدية معالجات وراثية أو دوائية ، وجعل ذبابة الفاكهة نموذجا مثاليا للحيوان التحقيق في الجوانب الفسيولوجية والجينية لالعصبي.
منذ خلايا عضلة كبيرة جدا ، قد يفضل البعض إضافة إلى خطوة إضافية لهذا البروتوكول لمدة تسجيل الجهد الكهربائي (TEVC) المشبك. ويمكن تنفيذ هذه اليرقات على التحضير لنفسها مع القطب الخلايا في مكان ، عن طريق وضع القطب الجاري يمر على الخلية. مرة واحدة في الخلية هو جهد كاف فرضت ، يمكن تسجيل الاستجابة الحالية.
على الرغم من العضلات 6 هو الأكثر استخداما للتسجيلات الكهربية ، ويمكن أيضا العضلات 7 و 12 يمكن استخدامها.
وصفت وسائل هنا تظهر أساسيات Drosophophila NMJ الكهربية -- التقنيات التي وصفت اول يناير عام 1976 ويناير ، وأصبحت منذ ذلك الحين في النظام النموذجي للبحث الفيزيولوجيا متشابك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
