Summary
כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.
Abstract
בסרטון זה, אנו מתארים את שיטות אלקטרו הקלטה בשידור סינפטי בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחל תסיסנית. מערכת הזחל neuromuscular היא סינפסה מודל לחקר הפיזיולוגיה עצבית הסינפטי ו, ו הוא כלי מחקר חשוב זה הגדיר גנטיקה נגיש מניפולציה ניסויית. הזחלים יכולים להיות גזור כדי לחשוף את הגוף קיר השרירים, מערכת העצבים המרכזית ומערכת העצבים ההיקפית. שרירי תסיסנית דפוס העצבוב שלהם מאופיינים היטב את שרירי קל לגשת להקלטה תאיים. שרירים בודדים ניתן לזהות על ידי מיקומם ואת כיוון בתוך 8 קטעים בטן, כל אחד עם 30 השרירים מסודרים דפוס זה חוזר על עצמו בקטעים A2 - A7. גזור הזחלים תסיסנית הם שרירי רזה הפרט צרורות של אקסונים הנוירון המוטורי ניתן דמיינו ידי שקוף
Protocol
לפני שמתחילים להכין:
- הנודד yhird instar הזחלים תסיסנית
- HL3.1 (השתנה hemolymph דמוי) פתרון
- Sylgard (גומי סיליקון שקוף) צלחות לנתיחה שהוכנו קטן (35 x 10 מ"מ) צלחות פטרי מפלסטיק בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008) 3.
- גזור סיכות לנתיחה קצר
- גירוי pipettes אלקטרודה
- הקלטה pipettes שארפ
HL3 פתרון:
- במהלך והניתוחים וניסויים אלקטרו, הזחל שקועים פתרון HL3.1 2 המכיל (מ"מ): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehalose, 115 סוכרוז, ו 5 HEPES, pH 7.2.
- ריכוזים של CaCl 2 מתווספים פתרון HL3.1 כדי לספק את הריכוז הדרוש של תאי Ca 2 +.
- הזחל והניתוחים מבוצעים על Ca 2 + בריכוז נמוך (כדי למנוע התכווצות שרירים) באמצעות HL3.1 + 0.25 mM CaCl 2, שמרה על הקרח.
- ניסויים אלקטרו נרשמות בדרך כלל HL3.1 + 1 mM CaCl 2, אבל זה יכול להיות מותאם 0.4-1 mM Ca 2 + כנדרש.
- הפתרון HL3.1 מעוקר לסנן לפני השימוש, ומאוחסנים ב 4 ˚ C.
הכנת מגרה הקלטה pipettes:
- Pipettes הקלטה מגרה נמשכים עם P-2000 סאטר חולץ מבוסס לייזר micropipette באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 390, נימה = 4, מהירות = 35, עיכוב = 200 ו - Pull = 0.
- אלקטרודות גירוי מוכנים מן דק דופן בורוסיליקט זכוכית נימים עם קצוות רחב כי היו מעט גדולים יותר מאשר רוחב של אקסונים המנוע ניתק. מסתיים בצורת הם firepolished לתת גימור חלק (בעזרת פיפטה Narashiga לטש), כדי למזער פגיעה בעצב. אלקטרודות גירוי מלאים פתרון אמבטיה (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +).
- אלקטרודות ההקלטה מוכנים מן הכוס בורוסיליקט 1.2 מ"מ, אשר משך להקים פיפטה חדה (30-60 mΩ), ומלא 3M KCl.
חלק 1: Dissection של הזחלים תסיסנית
- השלישי הזחלים instar נדודים הם גזור לחשוף את שרירי הגוף הקיר כפי שתואר לעיל 4.
- והניתוחים המבוצעים HL3.1 + 0.25 mM Ca 2 + על לוחות סיליקון קטן (35 x 10 מ"מ). HL3.1 הפתרון חייב להיות קר כקרח עבור והניתוחים על מנת לטשטש את הזחל, והוא שמר על הקרח לפני ובמהלך והניתוחים.
- הזחלים הם גזור בשיטות שתוארו על ידי ברנט מקייב (2008), כי הוא שונה עבור ניסויים electrophysiology ידי הוספת 0.25 mM Ca 2 + פתרון HL3.1 את הנתיחה, וכן באמצעות סיכות לנתיחה קצר (~ 2 מ"מ אורך), כי הם פחות סביר פגע אובייקטיבי מיקרוסקופ ואלקטרודות במהלך ניסוי.
- בעקבות לנתיחה, אקסונים את המנוע של הזחלים נותקו. הדבר נעשה על ידי בעדינות מחזיק את מערכת העצבים המרכזית והעלאת זה כל כך מעט העצבים ההיקפיים כי innervate את השרירים האחוריים עד הגנגליון הגחון ניתן לקצץ מבלי לפגוע בשרירים (איור 1). המוח הוא הוסר לאחר מכן.
- הכנה הזחל גזור נשטף פעמיים עם HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.
באיור 1. סכמטי המציג את הצעדים הכרוכים חיתוך האקסונים המנוע של הזחלים גזור. CNS היא הרים עם מלקחיים את האקסונים מנוע נחתכים בבסיס המוח.
חלק 2: הקלטות תאיים מתאי השריר הזחל.
- מניחים את צלחת לנתיחה על המיקרוסקופ electrophysiology ו להטביע את הכנה עם HL3.1 + 1.5 מ"מ Ca 2 + ולתקן את האלקטרודה אמבטיה כך במגע עם הפתרון.
- כל הניסויים מבוצעים על השריר 6 במגזר הבטן השלישי (A3). העצבים ההיקפיים כי innervate השרירים הם גירוי באמצעות אלקטרודה יניקה 5.
- מיקום האלקטרודה מגרה בצלחת הראשונה, כדי למנוע תנודות כאשר האלקטרודה תאיים נמצא במקום. מניחים את האלקטרודה מגרה באזור קרוב הנוירון המוטורי innervating שריר 6 וליישם שאיבה עדינה עד עצב הוא לחתוך בתוך פיפטה מזכוכית. היזהרו לא למתוח את העצבים כאשר יניקה מוחל. הרם את פיפטה מעט כך שזה לא נוגע שריר ומקם אותה כך שזה לא מושך על סיבי העצב בסלע (איור 2).
איור 2. סכימטי של השרירים ועל הנוירונים המנוע innervating קטע אחד של הבטן מתוך הגולם תסיסנית. המיקום של פיפטה מגרה עצבים ניתקה את האלקטרודה הקלטה במצב בו השרירים 6 מומחשים. - תוךהקלטות הסלולר עשויים עם microelectrodes חדה מלא 3M KCl. מיקום האלקטרודה הקלטה מעל מרכז שרירים 6 בקטע בטן השלישי (A3) ולהתאים את הקלט לקזז כך קורא אפס לפתרון אמבטיה. לאט לאט להוריד את האלקטרודה ואת הגישה את השריר תחת הגדלה אופטית גבוהה עד שזה נוגע משטח השרירים. צפה אוסצילוסקופ כדי לאשר את השריר כבר חדרו. פוטנציאל הממברנה מנוחה צריך להיות לפחות -60 mV, או בעל חיים לא אמור לשמש. ספוראדי הפוטנציאלים endplate מיניאטורי כעת אמור להיות גלוי. השאר את התא כדי לייצב למשך דקה אחת לפני שמתחילים להקליט.
- שינויים בפוטנציאל הממברנה מזוהים עם הבמה אקסון HS-2A ראש מגבר 2B Axoclamp והקליט עם Clampex v 8.2.0.235 (אקסון מכשירים). 2B Axoclamp הוא interfaced למחשב שמפעיל תוכנה pCLAMP ועובד בשיתוף עם ממשק Digidata 1322A.
- תאים נרשמו במשך 3 דקות בלי שום גירויים כדי למדוד את התגובות mEJP. עקבות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח מיני (Synaptosoft, v 6.0.3) לבין המשרעת בתדירות mEJP ונחוש.
גירוי עצבי:
- הסוף הכרות של הנוירון המוטורי מגורה עם סדרה של פולסים מתח מרובע (0.3 משך ms) בעצימות כי די בשני אקסונים מוטוריים, לעורר תגובות עקבית השריר כולו.
- הגירוי נוצר עם גנרטור מאסטר 8-הדופק, אשר מתוכנת לספק פולסים ברציפות על פי משך הזמן ושעות ההפסקה.
- אפשר חמש שניות בין גירוי להתאוששות הסינפטי על NMJ.
- בעת קביעת עוצמת הגירוי, מתחילים ברמה הנמוכה ביותר ולהגדיל את העוצמה באיטיות על מספר ניסויים. עוצמת הגירוי המינימלית כי התוצאות בתגובה עורר אמור לשמש בניסויים.
- כאשר עוצמת הגירוי המתאים הוא הגיע, צריך להיות אחד EJP מתחם אחד התכווצות שרירים שעורר הגירוי.
- שיא לפחות 10 הפוטנציאלים עורר מן השריר כל הממוצע אמפליטודות.
חלק 3: תוצאות נציג
איור 3. ההקלטה תאיים נציגת שריר 6 מראה את זה הוא עורר EJP בתגובה גירוי חשמלי של עצב סגמנטלי, ואת הפוטנציאלים ספורדיים endplate מיניאטורי, או mEJP של. EJP אמפליטודות בשריר 6 של הזחלים wild-type בריאים, כגון S קנטון, הם בדרך כלל סביב 40 mV ואת אמפליטודות mEJP בין 1-3 mV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו כאן לספק דרך מהירה יחסית רחבה כדי לזהות שינויים בתפקוד סינפטי ב NMJ. היכולת לבצע הקלטות אלקטרו באמצעות בעלי חיים שלמים in vivo, ולבצע מניפולציות גנטיות או תרופתי, לעשות תסיסנית מודל חיה אידיאלית לחקר היבטים פיזיולוגיים הגנטי של עצבית.
מכיוון שתאי השריר הם גדולים מאוד, חלקם אולי מעדיפים להוסיף צעד נוסף לפרוטוקול זה שתי מתח הקלטה אלקטרודה (TEVC) מהדק. זה יכול להתבצע על הכנת הזחל אותו עם האלקטרודה תאיים במקום, על ידי הצבת אלקטרודה הנוכחי עובר על התא. לאחר התא מתח מספיק מהודק, התגובה הנוכחית ניתן להקליט.
אף שריר 6 הוא הנפוץ ביותר עבור הקלטות electrophysiology, השרירים 7 ו - 12 יכול לשמש גם.
השיטות שתוארו כאן להראות את עיקרי Drosophophila NMJ electrophysiology - טכניקות תוארו לראשונה בשנת 1976 על ידי יאן יאן, ומאז הפכה את מערכת מודל למחקר הפיזיולוגיה הסינפטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
