Méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

Summary

Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.

Abstract

Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes électrophysiologiques pour l'enregistrement de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire (JNM) de la larve de drosophile. Le système des larves neuromusculaire est une synapse modèle pour l'étude de la physiologie synaptique et la neurotransmission, et est un précieux outil de recherche qui a défini la génétique et est accessible aux manipulations expérimentales. Les larves peuvent être disséqués pour exposer le corps mur de la musculature, système nerveux central, et les nerfs périphériques. Les muscles de la drosophile et de leur modèle d'innervation sont bien caractérisés et les muscles sont faciles d'accès pour l'enregistrement intracellulaire. Muscles individuels peuvent être identifiés par leur localisation et l'orientation dans les 8 segments abdominaux, avec chacun 30 muscles agencés selon un motif qui se répète dans des segments A2 - A7. Disséqué larves de drosophile sont des muscles minces et individuels et des faisceaux d'axones des neurones moteurs peuvent être visualisés par transillumination

Protocol

Avant de commencer préparer:

• Errant yhird stade drosophile larves
• HL3.1 (modification hémolymphe-like) solution de
• Plaques Sylgard dissection (caoutchouc de silicone transparent) préparés dans les petites (35 x 10 mm) des boîtes de Petri en plastique en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008) ^3.
• Couper la dissection broches courtes
• Stimuler les pipettes d'électrode
• Pipettes d'enregistrement de Sharp

HL3 Solution:

1. Pendant les dissections et les expériences d'électrophysiologie, de la larve sont immergés dans une solution à ² HL3.1 qui contient (en mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 tréhalose, le saccharose 115, et 5 HEPES, pH 7,2.
2. Les concentrations de CaCl ₂ sont ajoutés à la solution HL3.1 pour fournir la concentration requise de ^{Ca2 +.}
   • Dissections larves sont réalisées à faible teneur en Ca ^{2 +} concentration (pour éviter la contraction musculaire) à l'aide HL3.1 + 0,25 _mM de CaCl2, conservés sur la glace.
   • Expériences électrophysiologiques sont généralement enregistrés dans HL3.1 + 1 _mM de CaCl2, mais cela peut être ajusté de 0,4 à 1 mM de Ca ^{2 +} au besoin.
3. La solution est stérilisée par filtration HL3.1 avant utilisation, et conservés à 4 ˚ C.

Préparation de la stimulation et l'enregistrement des pipettes:

1. Pipettes d'enregistrement et de stimulation sont tirés avec une Sutter P-2000 Laser micropipette extracteur base en utilisant les paramètres suivants: chaleur = 390, Filament = 4, Vitesse = 35, Delay = 200 et Pull = 0.
2. Électrodes de stimulation sont préparés à partir de capillaires à paroi mince en verre borosilicate avec des extrémités larges qui ont été légèrement plus grand que la largeur de la axones moteurs coupés. Les extrémités en forme sont à Facettes pour donner une finition lisse (en utilisant une pipette Narashiga polisseuse), pour minimiser les dommages au nerf. Électrodes de stimulation sont remplis avec une solution de bain (HL3.1 + 1 mM de Ca ^{2 +).}
3. Les électrodes d'enregistrement sont préparés à partir de 1,2 mm de verre borosilicate, qui est tiré de former une pipette forte (30-60 mQ), et rempli de 3M KCl.

Partie 1: Dissection des larves de drosophile

1. Troisième stade larvaire errance sont disséqués afin d'exposer les muscles de la paroi du corps, comme décrit précédemment ^4.
2. Les dissections sont réalisées dans HL3.1 + 0,25 mM de Ca ^{2 +} sur des plaques de silicone de petite taille (35 x 10 mm). HL3.1 solution doit être glacée pour les dissections afin d'anesthésier la larve, et est conservé sur la glace avant et pendant les dissections.
3. Les larves sont disséqués en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008), qui est modifié pour les expériences d'électrophysiologie en ajoutant 0,25 mM de Ca ^{2 +} à la solution HL3.1 la dissection, et utilisant des goupilles de dissection courte (environ 2 mm de longueur) qui sont moins susceptible de heurter l'objectif du microscope et les électrodes lors d'une expérience.
4. Après dissection, les axones moteurs de la larve sont coupés. Cela se fait en douceur la tenue de la CNS et l'élevant légèrement pour les nerfs périphériques qui innervent les muscles postérieurs au ganglion ventral peut être coupé sans endommager les muscles (figure 1). Le cerveau est alors retiré.
5. La préparation des larves disséquées est lavé deux fois avec HL3.1 + 1 mM de Ca ^{2 +.}

Figure 1. Schéma montrant les étapes de la coupe du axones moteurs de larves disséquées. Le CNS est soulevé avec des pinces et des axones moteurs sont coupés à la base du cerveau.

Partie 2: enregistrements intracellulaires de cellules musculaires larvaires.

1. Placer la plaque sur le microscope de dissection d'électrophysiologie et de submerger la préparation avec HL3.1 + 1,5 mM de Ca ^{2 +} et de fixer l'électrode de bain donc il est en contact avec la solution.
2. Toutes les expériences sont réalisées sur le muscle 6 dans le troisième segment abdominal (A3). Les nerfs périphériques qui innervent les muscles sont stimulés à l'aide d'une électrode ^{d'aspiration 5.}
3. Position l'électrode de stimulation dans le premier plat pour éviter les vibrations lorsque l'électrode intracellulaire est en place. Placer l'électrode de stimulation dans le voisinage proche de la motoneurones innervant les muscles 6 et appliquer l'aspiration au doux jusqu'à ce que le nerf coupé est à l'intérieur de la pipette en verre. Soyez prudent de ne pas étirer les nerfs lorsque l'aspiration est appliquée. Levez la pipette légèrement de sorte qu'il ne touche pas le muscle et la position qu'elle sorte qu'il n'est pas en tirant sur les fibres nerveuses coupées (figure 2).
   
   Figure 2. Un schéma de la musculature et les neurones moteurs innervant d'un segment abdominal de la larve de drosophile. La position de la pipette stimulant et nerfs sectionnés et l'électrode d'enregistrement en position à six muscles sont illustrés.
4. Intraenregistrements cellulaires sont faites avec des microélectrodes forte remplie avec 3 M de KCl. Position de l'électrode d'enregistrement au dessus du centre de muscle 6 sur le troisième segment abdominal (A3) et régler le décalage d'entrée afin qu'il indique zéro pour la solution de bain. Abaisser lentement l'électrode et l'approche du muscle sous grossissement optique haute jusqu'à ce qu'elle touche la surface du muscle. Regardez l'oscilloscope pour confirmer que le muscle a été pénétrée. Le potentiel de repos membranaire doit être au moins à -60 mV, ou l'animal ne doit pas être utilisé. Sporadiques potentiels plaque motrice miniature doit maintenant être visible. Laisser la cellule se stabiliser pendant une minute avant de commencer à enregistrer.
5. Les changements dans le potentiel de membrane sont détectés avec un stade Axon tête SH-2A 2B et un amplificateur Axoclamp et enregistré avec Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Le 2B Axoclamp est interfacée à un ordinateur qui exécute un logiciel pClamp et fonctionne en conjonction avec l'interface Digidata 1322A.
6. Les cellules ont été enregistrées pendant 3 minutes sans aucun stimulus pour mesurer les réponses mEJP. Des traces ont été analysés en utilisant des logiciels d'analyse Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) et l'amplitude et la fréquence mEJP déterminée.

Stimulation du nerf:

1. La fin coupé du neurone moteur est stimulé par une série d'impulsions de tension carrée (0,3 ms) à une intensité qui est suffisant pour les deux axones moteurs, pour évoquer des réponses cohérentes dans le muscle entier.
2. Le stimulus est généré avec le Maître-8 générateur d'impulsions, qui est programmé pour délivrer des impulsions en permanence en fonction de la durée et des intervalles de temps.
3. Prévoyez cinq secondes entre les stimuli pour la récupération synaptique à la JNM.
4. Lors de la détermination de la force du stimulus, commencez par le bas niveau et d'augmenter l'intensité lentement sur plusieurs essais. L'intensité du stimulus minimum qui se traduit par une réponse évoquée doit être utilisé dans les expériences.
5. Lorsque l'intensité du stimulus approprié est atteint, il devrait y avoir une EJP composé et une contraction musculaire provoquée par le stimulus.
6. Marquer au moins 10 des potentiels évoqués de chaque muscle et la moyenne des amplitudes.

Partie 3: Résultats Représentant

Figure 3. Représentant enregistrement intracellulaire du muscle 6 montrant l'EJP évoqué est la réponse à une stimulation électrique du nerf segmentaire, et les potentiels sporadiques plaque motrice miniature, ou de mEJP. Amplitudes EJP dans le muscle sain 6 de type sauvage larves, comme Canton S, sont généralement autour de 40 mV et les amplitudes mEJP entre 1-3 mV.

Discussion

Les méthodes décrites ici fournissent un moyen rapide et relativement large pour détecter des changements dans la fonction synaptique à la JNM. La possibilité d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des animaux intacts in vivo, et effectuer des manipulations génétiques ou pharmacologiques, font la drosophile un modèle animal idéal pour étudier les aspects physiologiques et génétiques de la neurotransmission.

Comme les cellules musculaires sont très grandes, d'autres préfèrent ajouter une étape supplémentaire à ce protocole pour deux de tension de serrage des électrodes (TEVC) d'enregistrement. Ceci peut être réalisé sur la même préparation des larves avec l'électrode intracellulaire en place, par le positionnement d'une électrode de passage du courant sur la cellule. Une fois que la cellule est suffisamment serré de tension, la réponse actuelle peut être enregistrée.

Bien que les muscles 6 est le plus couramment utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques, les muscles 7 et 12 peuvent également être utilisés.

Les méthodes décrites ici montrent l'essentiel de Drosophophila JNM électrophysiologie - des techniques qui ont d'abord été décrite par Jan et Jan en 1976, et sont devenus le système modèle pour la recherche physiologie synaptique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Petri dishes (35 x 10 mm)	BD Biosciences	1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097366-1004
Dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	475002-9902
Light for microscope	Schott AG	KLI500
Dissection pins	Fine Science Tools	26002-10
pClamp 9 software	Molecular Devices	PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-0
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-2000
Pipette polisher	Narishige International	MF-83
Axon HS-2A head stage	Molecular Devices	Model HS-2A
Micromanipulators	Sutter Instrument Co.	MP-85
Axoclamp 2B amplifier	Molecular Devices	AXOCLAMP 2B
Clampex Software	Molecular Devices	v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3	Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier	Brownlee	Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	Sigma-Aldrich	p-9333
NaHCO3	Sigma-Aldrich	s6297-1kg
Trelahose	Sigma-Aldrich	TO167
Sucrose	Fisher Scientific	bp220-212
HEPES	Sigma-Aldrich	h-3375
MgCl-6H2O	Sigma-Aldrich	m2670-1kg
CaCl2	Fisher Scientific	c79-500
Master-8 Pulse Generator	A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up	Technical Manufacturing Corp.
Faraday Cage