Summary
在这里，我们描述了测量在果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理方法。发起人为诱发释放刺激运动神经元轴突，并通过NMJ传输，可在肌肉引起突触后反应测量。
Abstract
在这个视频中，我们描述记录果蝇幼虫神经肌肉接头处（NMJ）突触传递的电生理方法。幼虫神经肌肉系统是一个模型突触，突触生理学和神经递质的研究，是一个有价值的研究工具，已定义遗传学和实验操作。幼虫可解剖体壁肌肉，中枢神经系统，以及末梢神经暴露。果蝇的肌肉和他们的神经支配模式是很好的特点，很容易和肌肉细胞内记录访问。单独的肌肉可以识别8腹节安排在A2段重复的模式，每30肌肉内的位置和方向 - A7。解剖果蝇幼虫薄和个人肌肉的运动神经元轴突束可以透可视化
Protocol
在开始之前准备：
- 流浪yhird龄果蝇幼虫
- HL3.1（修改血淋巴样）解决方案
- Sylgard（透明硅橡胶）夹层板准备在小（35 × 10毫米）的塑料培养皿使用布伦特和麦凯布（2008年）3描述的方法菜肴。
- 削减夹层引脚短
- 刺激电极移液器
- 夏普录音移液器
HL3解决方案：
- 在解剖和电生理实验，幼虫都沉浸在HL3.1解决方案，其中包含（毫米）：70氯化钠，氯化钾，氯化镁2，10 4碳酸氢钠3，5海藻糖，115蔗糖，5 HEPES，pH值7.2。
- 氯化钙的浓度添加到HL3.1解决方案提供所需的细胞外Ca 2 +浓度。
- 幼虫解剖是在低Ca 2 +浓度（以避免肌肉收缩）使用HL3.1 + 0.25毫米氯化钙2，放在冰上。
- 电生理实验通常在HL3.1 + 1毫米氯化钙2，但是这可以从0.4调整- 1毫米的Ca 2 +的要求。
- HL3.1的解决办法是在使用前过滤消毒，并保存在4˚C。
刺激和记录的吸液管的制备：
- 记录和刺激移液器被拉到同一个萨特的P - 2000基于激光的微管使用以下设置拉马：热= 390，长丝= 4 = 35，速度，延迟= 200拉= 0。
- 刺激电极准备薄壁高硼硅玻璃毛细管，略高于切断电机轴突的宽度更大的宽两端。形两端firepolished给顺利完成（使用Narashiga吸管抛光），以尽量减少对神经的损害。刺激电极填充液（HL3.1 + 1毫米的Ca 2 +）。
- 记录电极准备从1.2mm高硼硅玻璃，这是拉，形成了尖锐的吸管（30-60MΩ），充满3M氯化钾。
第1部分：夹层果蝇幼虫
- 三龄幼虫徘徊解剖暴露在体壁的肌肉前面描述4。
- 解剖在HL3.1 + 0.25毫米的Ca 2 +（35 × 10毫米）小硅板。 HL3.1解决方案都必须以麻醉幼虫冰冷解剖和解剖之前和期间，冰。
- 幼虫解剖使用布伦特和麦凯布（2008年），即是修改加入0.25毫米的Ca 2 + HL3.1夹层解决方案，并使用少的短清扫引脚（1〜2毫米长）的电生理实验中所描述的方法显微镜物镜和电极有可能打在一个实验。
- 清扫之后，幼虫的运动轴突被切断。这是通过轻轻地捧着中枢神经系统，所以可以在不破坏肌肉（图1）切断周围神经支配的肌肉后向腹侧神经节略有提高。然后取出大脑。
- 解剖的幼虫准备洗两次与HL3.1 + 1毫米的Ca 2 + 。
图1显示在切割解剖幼虫的运动轴突所涉及的步骤示意图。中枢神经系统解除钳和运动轴突在大脑底部切割。
第2部分：从幼虫的肌肉细胞的细胞内记录。
- 广场上的电镜和淹没的准备与HL3.1夹层板+ 1.5毫米的Ca 2 +，所以在接触解决方案是修复浴电极。
- 在第三腹段（A3），所有的实验都进行肌肉6。周围神经支配的肌肉刺激使用吸入电极5。
- 在第一盘的刺激电极的位置，以避免震动，当细胞内的电极到位。刺激电极放置在邻近的运动神经元支配肌肉6，直到切断神经内的玻璃吸管轻轻吸。小心吸力时，不舒展神经。提高吸管轻微，所以它是不碰的肌肉和位置，以便它不切断神经纤维（图2）拉。
图2：从果蝇幼虫腹段的肌肉和支配运动神经元的示意图。刺激吸管和切断的神经和肌肉6位置的记录电极的位置说明。 - 内与3米氯化钾充满尖锐的微电极细胞的录音。以上的肌肉6第三腹段（A3）的中心位置的记录电极和调整的输入偏移，所以它读取零液。慢慢地降低电极和高光学倍率下的肌肉的方法，直到它触及肌肉表面。观看示波器确认的肌肉已经渗透。静息膜电位应至少-60 mV时，不应使用或动物。现在应该可见零星的微型终板潜力。离开细胞稳定一分钟才开始录制。
- 膜电位的变化是轴突HS - 2A头阶段，Axoclamp 2B放大器和检测记录Clampex v 8.2.0.235（Axon仪器）。 Axoclamp 2B是连接到一台运行pCLAMP软件和工程结合Digidata 1322A接口。
- 细胞记录为3分钟，没有任何刺激来衡量mEJP的反应。痕迹分析，使用Mini分析软件（Synaptosoft，V 6.0.3）和mEJP幅度和频率决定。
神经刺激：
- 到底是一个方形的电压脉冲（0.3毫秒）的强度是足够的，对于这两个运动轴突，一致的反应，以唤起整个肌肉的一系列刺激运动神经切断。
- 刺激产生的主8脉冲发生器，这是编程提供脉冲持续的时间和间隔时间。
- 允许5秒之间在NMJ突触恢复刺激。
- 确定刺激的强度时，开始的最低水平，并多次试验，强度缓慢增加。应在实验中使用的最小刺激强度，结果诱发反应。
- 当达到适当的刺激强度，应该有一个复合EJP和刺激诱发的肌肉收缩。
- 记录至少10个诱发电位的振幅从每一块肌肉和平均。
第3部分：代表结果
图3。代表从6肌肉细胞内记录显示诱发的EJP节段性神经电刺激和零星的微型终板电位，或mEJP的回应。 EJP幅度，在健康的野生型幼虫，如广东小号，6肌肉通常是大约40 mV和1-3之间MV mEJP幅度。
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Discussion
这里所描述的方法提供了一个相对快速和广泛的方式来检测在NMJ突触功能的改变。执行，使用完整的动物体内电生理记录，并执行遗传或药理操作的能力，使果蝇神经递质的生理和遗传方面的调查的一个理想的动物模型。
由于肌肉细胞是非常大的的，有些人可能希望添加一个额外的步骤，为两个电极电压钳（TEVC）记录本议定书。这可以执行相同的幼虫准备在细胞内的电极，通过对细胞定位的电流通过电极。一旦细胞足够的电压钳位，可以记录当前的响应。
虽然肌肉6电录音中使用最常用的为7和12，肌肉也可以使用。
这里所描述的方法显示Drosophophila NMJ电 - 在1976年首次月和1月的技术要领，并从此成为突触生理学研究的模型系统。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
