Summary
Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşakta sinaptik iletim ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Uyarılmış serbest motor nöron aksonları uyararak yapay olarak başlatılan ve iletim yoluyla NMJ kas uyarılmış postsinaptik tepki ölçülebilir.
Abstract
Bu video, sinaptik iletim, nöromüsküler Drosophila larva bileşke (NMJ) kayıt için elektrofizyolojik yöntemler açıklanmaktadır. Larva nöromüsküler sistemi için bir model Sinaps, sinaptik fizyolojisi ve nörotransmisyon çalışma ve genetik tanımlanmış ve deneysel manipülasyon erişilebilir değerli bir araştırma aracı. Larva maruz vücut duvarı kas, merkezi sinir sistemi ve periferik sinirlerin disseke edilebilir. Drosophila ve innervasyon desen kasları iyi karakterize edilir ve kasların hücre içi kayıt için erişimi kolay. A7 - Bireysel kasları 8 karın segmentleri segmentlerinde A2 tekrarlanan bir model olarak düzenlenmiş her 30 kas içinde kendi konumunu ve yönünü tespit edilebilir. Disseke Drosophila larvaları, ince ve bireysel kasları ve motor nöron akson demetleri transillüminasyon tarafından görüntülenmiştir
Protocol
Önce başlangıç hazırlar:
- Wandering yhird instar Drosophila larvaları
- HL3.1 (hemolimf-benzeri Değiştirilmiş) çözümü
- Brent ve McCabe (2008) 3 tarafından açıklanan yöntemleri kullanarak küçük (35 x 10 mm) plastik petri kaplarına Sylgard (şeffaf silikon kauçuk) diseksiyonu plakaları hazırlanmıştır.
- Diseksiyonu pimleri kısa kesilmiş
- Elektrot pipetler teşvik
- Keskin kayıt pipetler
HL3 Çözüm:
- 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trehaloz, 115 sakaroz, 5 Hepes, pH 7,2: diseksiyonlar ve elektrofizyolojik deneyler sırasında larva HL3.1 çözüm 2 (mM) içeren daldırılır.
- CaCl 2 konsantrasyonları ekstraselüler Ca 2 + gerekli konsantrasyonu sağlamak için HL3.1 çözüm eklenir.
- Larvaların diseksiyonları HL3.1 kullanarak + konsantrasyonları (kas kasılması önlemek için) + 0.25 mM CaCl 2, buz üzerinde tutulmalıdır düşük Ca 2 yapılmaktadır.
- Elektrofizyolojik deneyler genellikle HL3.1 kaydedilir + 1 mM CaCl 2, ama bu 0.4 ile ayarlanabilir - 1 mM Ca 2 + gerektiği gibi.
- HL3.1 çözüm filtresi kullanımdan önce sterilize ve 4 saklanan ˚ C
Pipetler uyarıcı ve kayıt hazırlanması:
- Isı = 390, Filament = 4, Hız = 35 = 200 Gecikme ve = 0 çekin: Kayıt ve uyarıcı pipetler aşağıdaki ayarları kullanarak bir Sutter P-2000 Lazer tabanlı mikropipet çektirmesi ile çekilir.
- Uyarıcı elektrot kopmuş motor aksonlar genişliği biraz daha geniş biter ince duvarlı borosilikat cam kapilerleri hazırlanmıştır. Şeklinde uçları sinir hasarı en aza indirmek için düzgün bir yüzey (bir Narashiga pipet parlatıcı kullanarak) vermek firepolished. Uyarıcı elektrot banyo solüsyonu (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +) ile doldurulur.
- Kayıt elektrotlar keskin bir pipet (M 30-60) oluşturmak için çekti ve 3M KCl ile dolu 1.2mm borosilikat cam, hazırlanmıştır.
Bölüm 1: Drosophila Larva Diseksiyon
- Üçüncü instar dolaşan larvalar daha önce 4 açıklandığı gibi vücut duvarı kasları ortaya çıkarmak için disseke.
- Diseksiyonlarının HL3.1 yapılmaktadır + 0.25 mM Ca 2 + küçük silikon plakalar (35 x 10 mm). Larva uyuşturan için diseksiyonlarının buz HL3.1 çözüm olmalıdır ve diseksiyonlarının öncesinde ve sırasında buz üzerinde tutulmalıdır.
- Larva HL3.1 diseksiyonu çözüm + 0.25 mM Ca 2 ekleyerek ve daha az olan kısa diseksiyonu pimleri (~ 2 mm uzunluğunda) kullanılarak elektrofizyoloji deneyler için değiştirilmiş Brent ve McCabe (2008), tarafından açıklanan yöntemleri kullanarak disseke bir deney sırasında mikroskop objektif ve elektrotlar vurmak olasıdır.
- Diseksiyonu takiben, larvaların motor aksonlar kopmuş. Bu MSS nazikçe tutarak ve ventral ganglion arka kasları innerve periferik sinirler kasları (Şekil 1) zarar vermeden kesim böylece biraz yükselterek tarafından yapılır. Daha sonra beyin kaldırılır.
- Disseke larval hazırlık HL3.1 ile iki kez yıkanır + 1 mM Ca 2 +.
Şekil 1 disseke larvaların motor aksonlar kesme yer alan adımları gösteren şematik. MSS forseps ile kaldırdı ve motor aksonlar, beyin tabanında kesilir.
Bölüm 2: larva kas hücrelerinde intrasellüler kayıtları.
- Elektrofizyoloji mikroskop ve batığın HL3.1 ile hazırlık diseksiyonu plaka + 1.5 mM Ca 2 + koyun ve çözüm ile temas halinde olduğu, bu nedenle banyo elektrot düzeltmek .
- Bütün deneyler, üçüncü karın segment (A3) içinde kas 6 yapılmaktadır. Periferik sinirler kasları innerve emme elektrot 5 kullanarak uyarılır.
- Intrasellüler elektrot yerinde titreşimleri önlemek için çanak ilk uyarıcı elektrot yerleştirin. 6 kas innerve motor nöron yakınında uyarıcı elektrot yerleştirin ve kesme sinir cam pipet içine kadar nazik vakum uygulamak. Emme uygulandığında sinirleri germek için dikkatli olun. Biraz bu yüzden, bu yüzden kesim sinir lifleri (Şekil 2) üzerine çekerek değil kas ve pozisyon dokunmadan değildir pipet kaldırın.
Şekil 2 Drosophila larva bir karın segment kas ve motor nöronlar innerve şematik. Kas 6 uyarıcı pozisyonda pipet ve sinirler kopmuş ve kayıt elektrot pozisyonu gösterilmiştir. - İntra3 M KCl ile dolu keskin Mikroelektronlar hücresel kayıtları yapılır. Üçüncü karın segment (A3) kas 6 merkezinin üstünde kayıt elektrodu yerleştirin ve banyo çözümü için sıfırı ofset girişi ayarlayabilirsiniz. Elektrot yavaş yavaş alt ve kas kas yüzeyi dokunana kadar yüksek optik büyütme altında yaklaşım. Kas nüfuz doğrulamak için osiloskop izleyin. Dinlenme zar potansiyeli -60 mV en az olmalı, ya da hayvan kullanılmamalıdır. Sporadik minyatür son plağın potansiyelleri şimdi görünür olmalıdır. Kayıt yapmaya başlamadan önce bir dakikalık stabilize olması için hücre bırakın.
- Membran potansiyeli değişiklikler bir Axon HS-2A kafa sahne ve Axoclamp 2B amplifikatör ile tespit ve Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments) ile kaydedilir. Axoclamp 2B pCLAMP yazılım ve Digidata 1322A arayüzü ile birlikte çalışır çalışan bir bilgisayar arayüzü.
- Hücreler mEJP tepkileri ölçmek için herhangi bir uyarana olmadan 3 dakika kaydedildi. İzler Mini analiz yazılımı (Synaptosoft, v 6.0.3) ve belirlenen mEJP genlik ve frekans kullanılarak analiz edildi.
Sinir Uyarım:
- Motor nöron kopmuş sonunda tüm kas tutarlı tepkiler uyandırmak, hem de motor aksonlar için yeterli bir yoğunluk kare voltaj darbeleri (0.3 ms süresi) bir dizi ile uyarılır.
- Uyaran süresi ve aralığı kez göre sürekli darbeler sunmak için programlanmış Master-8 darbe jeneratör, ile üretilir.
- NMJ sinaptik kurtarma uyaranlar arasında beş saniye bekleyin.
- Uyaran gücünü belirlerken, en düşük seviyesi ile başlar ve birkaç denemeden içinde yavaş yavaş yoğunluğunu arttırmak. Uyarılmış bir tepki olarak sonuçları en az uyaran yoğunluğu deneylerde kullanılması gerekir.
- Uygun bir uyaran şiddeti ulaşıldığında, bir bileşik EJP ve bir kas kasılması uyaran tarafından uyarılmış olması gerekir.
- Her kas ve ortalama genlikleri en az 10 uyarılmış potansiyeller kaydedin.
Bölüm 3: Temsilci Sonuçlar
Şekil 3 uyarılmış EJP gösteren kas 6 Temsilcisi intraselüler kayıt segmental sinirin elektriksel stimülasyon ve sporadik minyatür son plağın potansiyelleri, ya da mEJP yanıt. Kanton G gibi sağlıklı yabani tip larvaları, 6 kas EJP genlikleri, genellikle yaklaşık 40 mV ve 1-3 mV arasında mEJP amplitüdleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemler NMJ sinaptik fonksiyon değişiklikleri algılamak için nispeten hızlı ve geniş bir yol sağlar. In vivo elektrofizyolojik kayıtlar bozulmamış hayvanların kullanarak gerçekleştirmek ve genetik ya da farmakolojik manipülasyonlar yapmak için yetenek, Drosophila nörotransmisyon fizyolojik ve genetik açıdan araştırmak için ideal bir hayvan modeli olun.
Kas hücreleri çok büyük olduğundan, bazı iki elektrot voltajı kelepçe (TEVC) kayıt için bu protokole ek bir adım eklemek için tercih edebilirsiniz. Bu hücre bir akım geçerken elektrot konumlandırma, hücre içi elektrot ile aynı larva hazırlık olabilir. Hücre kelepçeli yeterince gerilim sonra, geçerli yanıt kaydedilebilir.
Kas 6 elektrofizyoloji kayıtları için kullanılan en yaygın olmasına rağmen, kaslar 7 ve 12 de kullanılabilir.
Burada açıklanan yöntemler Drosophophila NMJ elektrofizyoloji şartları göstermek - ilk kez 1976 yılında Jan ve Oca tarafından açıklanan teknikler, ve o zamandan beri sinaptik fizyolojisi araştırmak için model sistem haline gelmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | BD Biosciences | 1008 | |
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | 475002-9902 | |
| Light for microscope | Schott AG | KLI500 | |
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pClamp 9 software | Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | |
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | |
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 | |
| Pipette polisher | Narishige International | MF-83 | |
| Axon HS-2A head stage | Molecular Devices | Model HS-2A | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument Co. | MP-85 | |
| Axoclamp 2B amplifier | Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | |
| Clampex Software | Molecular Devices | v 8.2.0.235 | |
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | ||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | |
| NaCl | Baker/VWR | 4058-01 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | p-9333 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | s6297-1kg | |
| Trelahose | Sigma-Aldrich | TO167 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | bp220-212 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | h-3375 | |
| MgCl-6H2O | Sigma-Aldrich | m2670-1kg | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | c79-500 | |
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | ||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
