Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Summary

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Abstract

Neste vídeo, descrevemos os métodos eletrofisiológicos para a gravação da transmissão sináptica na junção neuromuscular (MNJ) da larva Drosophila. O sistema neuromuscular é uma sinapse larval modelo para o estudo da fisiologia sináptica e neurotransmissão, e é um valioso instrumento de pesquisa que definiu a genética e é acessível à manipulação experimental. As larvas podem ser dissecado para expor o corpo musculatura da parede, sistema nervoso central, e os nervos periféricos. Os músculos de Drosophila e seu padrão de inervação estão bem caracterizadas e os músculos são de fácil acesso para gravação intracelular. Músculos individuais podem ser identificados por sua localização e orientação dentro do 8 segmentos abdominais, cada um com 30 músculos dispostos em um padrão que se repete em segmentos A2 - A7. Dissecados larvas de drosófila são músculos finos e individuais e feixes de axônios do neurônio motor pode ser visualizado por transiluminação

Protocol

Antes de iniciar preparar:

• Wandering yhird instar as larvas Drosophila
• HL3.1 solução (Modificado hemolinfa-like)
• Placas Sylgard (borracha de silicone transparente) dissecção preparado em pequena (35 x 10 mm) pratos de plástico petri usando métodos descritos por Brent e McCabe (2008) ^3.
• Cortar pinos dissecção curta
• Estimulando pipetas eletrodo
• Afiada pipetas de gravação

HL3 Solução:

1. Durante as dissecções e experimentos eletrofisiológicos, larva são imersos em solução de ² HL3.1 que contém (em mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 trealose, 115, sacarose e 5 HEPES, pH 7.2.
2. Concentrações de CaCl ₂ são adicionados à solução HL3.1 para fornecer a concentração necessária de Ca ^{2 +} extracelular.
   • Dissecções larvas são realizados em baixa Ca ^{2 +} concentrações (para evitar a contração muscular), utilizando HL3.1 + 0,25 mM CaCl _2, mantido em gelo.
   • Experimentos eletrofisiológicos são normalmente registrados em HL3.1 + 1 mM CaCl _2, mas isso pode ser ajustado 0,4-1 mM Ca ^{2 +,} conforme necessário.
3. A solução é HL3.1 filtro esterilizadas antes do uso, e armazenados a 4 ˚ C.

Preparação de estimulação e registro pipetas:

1. Pipetas de gravação e estimulantes são puxados com um P-2000 Sutter extrator Laser micropipeta com base utilizando as seguintes definições: Calor = 390, Filamento = 4 Velocity, = 35, Delay = 200 e Pull = 0.
2. Eletrodos estimulantes são preparados a partir de paredes finas de vidro de borosilicato capilares com extremidades largas que eram ligeiramente maior que a largura da axônios motores cortados. As extremidades moldadas são firepolished para dar um acabamento liso (usando uma pipeta Narashiga polidor), para minimizar os danos ao nervo. Eletrodos estimulantes são preenchidos com solução de banho (HL3.1 + 1 mM Ca ^{2 +).}
3. Os eletrodos de gravação são preparados a partir de 1,2 milímetros de vidro de borosilicato, que é puxado para formar uma pipeta afiada (30-60 mohms), e preenchido com KCl 3M.

Parte 1: Dissecção de larvas de Drosophila

1. Larvas de terceiro estádio errantes são dissecados para expor os músculos da parede do corpo, conforme descrito anteriormente ^4.
2. Dissecções são realizados em HL3.1 + 0,25 mM Ca ^{2 +} em placas de silicone pequena (35 x 10 mm). HL3.1 solução deve ser gelada para dissecções, a fim de anestesiar a larva, e é mantido no gelo antes e durante a dissecção.
3. As larvas são dissecados usando métodos descritos por Brent e McCabe (2008), que é modificado para experimentos de eletrofisiologia, adicionando 0,25 mM Ca ^{2 +} para a solução dissecção HL3.1, e utilizando pinos de dissecção de curta duração (~ 2 mm de comprimento) que são menos probabilidade de acertar a objetiva do microscópio e eletrodos durante um experimento.
4. Após dissecação, os axônios motores das larvas são cortados. Isto é feito com cuidado, segurando o SNC e elevá-la ligeiramente para os nervos periféricos que inervam os músculos posteriores ao gânglio ventral pode ser cortada sem danificar os músculos (Figura 1). O cérebro é então removido.
5. A preparação das larvas dissecadas é lavada duas vezes com HL3.1 + 1 mM Ca ^{2 +.}

Figura 1. Esquemático mostrando as etapas envolvidas no corte os axônios motores de larvas dissecadas. O CNS é levantado com uma pinça e os axônios motores são cortadas na base do cérebro.

Parte 2: gravações intracelular das células musculares larval.

1. Coloque a placa de dissecção no microscópio eletrofisiologia e submergir a preparação com HL3.1 + 1,5 mM Ca ^{2 +} e fixar o eletrodo banho assim que está em contato com a solução.
2. Todos os experimentos são realizados no músculo seis dentro do terceiro segmento abdominal (A3). Nervos periféricos que inervam os músculos são estimulados através de um eletrodo de sucção ^5.
3. Posição do eletrodo de estimulação no primeiro prato, para evitar vibrações quando o eletrodo intracelular está no lugar. Coloque o eletrodo estimulando nas imediações do neurônio motor inerva músculo 6 e aplicar sucção suave até que o nervo corte está dentro da pipeta de vidro. Tenha cuidado para não esticar os nervos quando a sucção é aplicada. Elevar a pipeta ligeiramente por isso não está tocando o músculo e posicioná-lo por isso não é puxando as fibras nervosas cortadas (Figura 2).
   
   Figura 2. Um esquema da musculatura e dos neurônios motores, que inervam de um segmento abdominal da larva Drosophila. A posição da pipeta estimulante e nervos cortados eo eletrodo de gravação na posição em músculo 6 são ilustrados.
4. Intragravações de celulares são feitos com microeletrodos afiada cheia com 3 M KCl. Posição do eletrodo de registro acima do centro do músculo 6 no terceiro segmento abdominal (A3) e ajustar a entrada compensado assim que lê zero para a solução do banho. Abaixe lentamente o eletrodo e se aproximar do músculo sob ampliação ótica de alta até tocar a superfície do músculo. Assista o osciloscópio para confirmar que o músculo tenha sido penetrado. O potencial de repouso deve ser de pelo menos -60 mV, ou o animal não deve ser usado. Esporádicos potenciais de placa terminal em miniatura deverão ser agora visíveis. Deixe o celular para estabilizar por um minuto antes de começar a gravar.
5. Mudanças no potencial de membrana são detectados com um estágio de cabeça Axon HS-2A e 2B Axoclamp um amplificador e gravou com Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). A 2B Axoclamp é conectado a um computador que executa o software pCLAMP e funciona em conjunto com a interface Digidata 1322A.
6. As células foram gravadas por 3 minutos, sem qualquer estímulo para medir as respostas mEJP. Traços foram analisados ​​usando o software de análise Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e da amplitude mEJP e freqüência determinada.

A estimulação do nervo:

1. O final cortado do neurônio motor é estimulado com uma série de pulsos de voltagem quadrados (0,3 ms de duração) em uma intensidade que é suficiente para ambos os axônios motores, para evocar respostas consistentes em todo o músculo.
2. O estímulo é gerado com o Mestre-8 gerador de pulsos, que é programado para entregar pulsos continuamente de acordo com a duração e os tempos de intervalo.
3. Permitir que cinco segundos entre os estímulos para a recuperação sináptica no MNJ.
4. Ao determinar a força do estímulo, começar com o nível mais baixo e aumentar a intensidade lentamente ao longo de vários ensaios. A intensidade do estímulo mínimo que resulta em uma resposta evocada deve ser usado em experimentos.
5. Quando a intensidade do estímulo adequado é alcançado, deve haver uma EJP composto e uma contração muscular evocada pelo estímulo.
6. Registro de pelo menos 10 potenciais evocados de cada músculo e média as amplitudes.

Parte 3: Resultados Representante

Figura 3. Intracelular gravação Representante do músculo 6 mostrando o evocado EJP é resposta à estimulação elétrica do nervo segmentar, e os potenciais de placa terminal em miniatura esporádicos, ou mEJP é. EJP amplitudes no músculo 6 de larvas do tipo selvagem saudáveis, como Canton S, são normalmente em torno de 40 mV e as amplitudes mEJP entre 1-3 mV.

Discussion

Os métodos descritos aqui oferecem uma maneira relativamente rápida e ampla para detectar mudanças na função sináptica no MNJ. A capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas usando animais intactos in vivo, e executar manipulações genéticas ou farmacológicas, fazer Drosophila um modelo animal ideal para investigar os aspectos fisiológicos e genéticos da neurotransmissão.

Como as células musculares são muito grandes, alguns podem preferir adicionar um passo adicional para este protocolo por dois tensão de gravação clamp eletrodo (TEVC). Isto pode ser feito na mesma preparação larval com o eletrodo intracelular no lugar, posicionando-se um eletrodo de corrente que passa sobre a célula. Uma vez que o celular é suficientemente tensão preso, a resposta atual pode ser gravado.

Embora muscular 6 é o mais comumente usado para gravações de eletrofisiologia, os músculos 7 e 12 também podem ser usados.

Os métodos descritos aqui mostram o essencial do Drosophophila MNJ eletrofisiologia - técnicas que foram pela primeira vez descrito por Jan Jan e em 1976, e desde então se tornaram o sistema modelo para pesquisar fisiologia sináptica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Petri dishes (35 x 10 mm)	BD Biosciences	1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	3097366-1004
Dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	475002-9902
Light for microscope	Schott AG	KLI500
Dissection pins	Fine Science Tools	26002-10
pClamp 9 software	Molecular Devices	PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-0
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)	World Precision Instruments, Inc.	1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	Model P-2000
Pipette polisher	Narishige International	MF-83
Axon HS-2A head stage	Molecular Devices	Model HS-2A
Micromanipulators	Sutter Instrument Co.	MP-85
Axoclamp 2B amplifier	Molecular Devices	AXOCLAMP 2B
Clampex Software	Molecular Devices	v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3	Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier	Brownlee	Model 410
NaCl	Baker/VWR	4058-01
KCl	Sigma-Aldrich	p-9333
NaHCO3	Sigma-Aldrich	s6297-1kg
Trelahose	Sigma-Aldrich	TO167
Sucrose	Fisher Scientific	bp220-212
HEPES	Sigma-Aldrich	h-3375
MgCl-6H2O	Sigma-Aldrich	m2670-1kg
CaCl2	Fisher Scientific	c79-500
Master-8 Pulse Generator	A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up	Technical Manufacturing Corp.
Faraday Cage