Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Aqui nós demonstramos uma forma fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo reagentes padrão usando.
Abstract
Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Com este método, o gene-alvo clonados podem ser alterados pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ela funciona por simplesmente ampliar o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada, são integrados no plasmídeo recém-sintetizada. Neste vídeo tutorial vamos demonstrar uma maneira fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo. O protocolo trabalha com reagentes de referência e é independente de kits comerciais, que muitas vezes são muito caros. Aplicando este protocolo pode reduzir o custo total de uma reação a um oitavo do que custa o uso de alguns dos kits comerciais. Neste vídeo também comentar sobre as etapas críticas durante o processo e dar instruções detalhadas sobre como desenhar os iniciadores mutagênicos.
Protocol
Princípio do método: O site dirigido mutagênese de plasmídeos toda explicada neste vídeo é um método de mutagênese que permite que você alterar um gene alvo clonado pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ele funciona, amplificando o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original, …
Discussion
Mutagênese dirigida local é um método de mutagênese, que fornece uma maneira rápida de mutação de um gene transportado por um plasmídeo. A reação geral pode ser feito em apenas um dia. Com este método, ele vai precisar de apenas um par de primers complementares levando a mutações desejadas e uma revisão da polimerase como Pfu Polimerase. O plasmídeo recém-sintetizado pode ser separado do plasmídeo parental por digerir a reação com o DpnI enzima de restrição. Esta enzima digere apenas o DNA metilado….