نحن تصف كيفية قياس بالقرب من الغشاء والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا النجمية في تربيتها باستخدام الانعكاس الداخلي الكامل وepifluorescence المجهري.
يحتوي على خلايا الدماغ الدبقية. منذ فترة طويلة النجمية ، وهو نوع من الخلايا الدبقية ، والمعروفة لتوفير دور سلبي داعمة لخلايا عصبية. ومع ذلك ، أدلة متزايدة تشير إلى أن الخلايا النجمية ويمكن أيضا المشاركة بنشاط في وظائف المخ من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الوظيفية. ومع ذلك ، العديد من الجوانب الأساسية لعلم الأحياء نجمية تظل مثيرة للجدل ، غير واضحة و / أو غير مستكشفة تجريبيا. مسألة واحدة مهمة هي ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا العابرين في الخلايا النجمية. هذا هو ذات الصلة لأن راسخة الكالسيوم ورسوله في المركز الثاني والمهم أنه تم اقترح أن ترتفع نجمية الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى الإفراج عن الإرسال من الخلايا النجمية. ومع ذلك ، لم يكن هناك أي وصف تفصيلي أو مرضية من الكالسيوم غشاء البلازما بالقرب من الإشارات في الخلايا النجمية. مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) المجهر هو أداة قوية لتحليل الأحداث ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يشير ضمن حوالي 100 نانومتر للغشاء البلازما للخلايا الحية. هنا ، فإننا نستخدم TIRF المجهري ويصف كيفية مراقبة بالقرب من غشاء البلازما والعالمية ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد تقريبا. لمزيد من الصقل والتطبيق المنهجي لهذا النهج لديه القدرة على إبلاغ عن التفاصيل الدقيقة للإشارات الكالسيوم نجمية. قد يكون فهم مفصل لديناميات نجمية الكالسيوم توفر أساسا لفهم إذا ، كيف ومتى ولماذا النجمية والخلايا العصبية التي تعتمد على الكالسيوم الخضوع تفاعلات وظيفية.
هو راسخ بأن النجمية عرض ترتفع الكالسيوم داخل الخلايا. ويمكن أن تظهر هذه تحدث بشكل عفوي ، من خلال نشاط الخلايا العصبية أو عن طريق تطبيق منبهات لتنشيط المستقبلات على سطح خلية نجمية 11. مسألة واحدة مهمة ومثيرة للجدل هو ما إذا كانت الخلايا نجمية ترتفع الكالسيوم يمكن أن تؤدي إلى …
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة ميموريال أوهارا اليابان (لES) وكذلك مؤسسة وايتهول ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية وجائزة الهبات شتاين – أوبنهايمر (لBSK).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |