Summary
Descrevemos como medir perto da membrana e global a dinâmica do cálcio intracelular em astrócitos cultivados utilizando reflexão interna total e microscopia de epifluorescência.
Abstract
O cérebro contém células da glia. Astrócitos, um tipo de célula glial, tem sido conhecido por fornecer um papel passivo de apoio aos neurônios. No entanto, evidências crescentes sugerem que os astrócitos também podem participar ativamente na função cerebral por meio de interações funcionais com os neurônios. No entanto, muitos aspectos fundamentais da biologia astrócitos permanecem controversas, pouco clara e / ou experimentalmente inexplorado. Uma questão importante é a dinâmica dos transientes de cálcio intracelular em astrócitos. Isso é relevante porque o cálcio é bem estabelecido como um importante mensageiro segundo e porque tem sido proposto que a elevação de cálcio astrócitos pode desencadear a liberação de transmissores de astrócitos. No entanto, não houve qualquer descrição detalhada ou satisfatória de cálcio perto da membrana plasmática de sinalização em astrócitos. Reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma ferramenta poderosa para analisar fisiologicamente relevantes eventos de sinalização dentro de cerca de 100 nm da membrana plasmática de células vivas. Aqui, usamos a microscopia TIRF e descrever como monitor perto de membrana plasmática e global a dinâmica do cálcio intracelular quase simultaneamente. O aperfeiçoamento e aplicação sistemática desta abordagem tem o potencial de informar sobre os detalhes precisos de sinalização de cálcio astrócitos. Um entendimento detalhado da dinâmica de cálcio astrócitos pode fornecer uma base para entender se, como, quando e por que astrócitos e neurônios sofrem de cálcio dependentes de interações funcionais.
Protocol
Procedimentos experimentais
O procedimento experimental consiste de duas partes principais que são descritas em uma maneira passo sábio abaixo.
Parte 1: PREPARAÇÃO cultura de astrócitos hipocampais
Brevemente, misturado astrócitos do hipocampo neurônio-culturas foram preparadas usando um protocolo bem estabelecido 1,2,3. Nós otimizamos o procedimento para produzir saudável astrócitos em cultura. Todos os procedimentos listados abaixo devem ser realizadas em um ambiente estéril, como uma capela de fluxo laminar.
Lamínulas preparar
- 22 lamínulas mm (VWR, 48380-068)
- Poli-D-lisina (PDL, Sigma P0899), alíquotas (1 mg / ml)
- Laminina alíquotas (20 mcg / ml): adicione 49 ml de água estéril a 1 mg / ml solução laminina (Sigma L2020), fazer 1,2 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C
- PDL dissolver em água estéril (50 mcg / ml)
- Autoclave as lamelas, enxágüe com água estéril e colocar em PDL (20 ml para 100 lamínulas). Deixar à temperatura ambiente durante a noite.
- Substituir PDL com água estéril (3 lavagens extensa). Em seguida, seque as lamelas e armazenar a 4 ° C.
- O dia antes do plaqueamento os astrócitos lamínulas, lugar individual em um poço estéril em uma placa de 6 poços (com vários poços de fundo plano Placas com tampas, estéril de BD Bioscience). Coloque 400 mL de laminina em cada lamela e incubar durante a noite, na incubadora para evitar a evaporação.
Dissecação
Media dissecção:
- 500 ml de Earle solução salina balanceada (EBSS) (1X), líquido (Invitrogen, 14155-063)
- 5 ml solução HEPES (Sigma, H0887)
Media do hipocampo:
- 412,5 ml Médio Mínimo Essencial (MEM) (1X), líquido Contém sais de Earle, mas nenhum vermelho L-glutamina ou de fenol (Invitrogen, 51200-038)
- 10 ml de glicose (Sigma, D-(+) glicose-ANIDRO SIGMA ULTRA G7528) 1 M em MEM
- 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122)
- 5 ml de solução de piruvato de sódio (Sigma, S8636)
- 12,5 ml de solução 1 M HEPES (Sigma, H0887)
- 5 ml Suplemento N-2 (100X), líquido (Invitrogen, 17502-048)
- 50 ml de soro do cavalo, inativado pelo calor (Invitrogen, 26050-088)
Solução de papaína:
- Adicionar 5 ml de mídia dissecção em Worthington frasco papaína-022 (LK003178; concentração final, 20 U / ml) e incubar a 37 ° C por 60 min.
- Decapitar filhotes de ratos com idades entre P1 (geralmente 2 filhotes) seguindo as diretrizes analisados e aprovados por normas nacionais e seu Animal Care locais Institucional e Comitê de uso.
- Retire a pele e crânio e do cérebro lugar na placa de Petri cheia de mídia dissecção fria.
- Removido meninges, dissecar ambos os hemisférios e dissecar hipocampo.
- Pique o hipocampo em ~ 1X1 peças mm e digerir papaína em solução a 37 ° C por min 11-13.
- Uma vez que as peças de tecido se instalaram, remova cuidadosamente papaína e adicionar 5 ml de meio do hipocampo para remover todos os vestígios da enzima. Repita este passo e ressuspender em meio hipocampo (2 ml).
- Triturar as células ~ 5 vezes até que não haja aglomerações esquerda, com três chama-polido pipetas de furos progressivamente menores (1000 M, ~ 500 mm e ~ 300 mm).
- Uma vez triturado, passe as células através de um filtro de células (tamanho dos poros, 70 mM, BD Bioscience). Contar as células em 10 ml de suspensão. Ajustar o volume do meio do hipocampo, a fim de ter 400 mil células / ml.
- Aspirar o laminina off as lamelas, e antes do cobre pode secar, placa de 200 mL da suspensão de células por lamínula.
- Deixá-los para anexar por 60 min na incubadora, e depois adicionar 2 ml de meio de hipocampo por poço.
- No dia seguinte, aspire média de idade do hipocampo para remover células mortas e detritos e adicionar 2 ml de pré-aquecido meio fresco do hipocampo.
Manutenção
Media Neurobasal:
- 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 ml de soro livre suplemento B27 (Invitrogen, 17504-044)
- 5 ml Penicilina-estreptomicina (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 ml L-glutamina (Invitrogen, 25030-149)
Alimentar a cultura de astrócitos neurônio-duas vezes por semana com o meio neurobasal, começando quatro dias após o plaqueamento. Pré-incubação da media cerca de 30 min na incubadora em um frasco ventilado para equilibrar a temperatura e CO 2.
Parte 2: IMAGING CÁLCIO
Buffer de gravação do hipocampo: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 10 mM D-glicose, 10 mM HEPES (Todos os produtos químicos da Sigma) pH 7,4 (ajustado com NaOH).
Corante indicador de carga de cálcio em astrócitos
- Lugar a cultura em um poço em uma placa de seis bem-cheia com 2 ml de buffer de gravação contendo 2,5 mM hipocampo Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) e 0,05% PLURONIC solução ® F-127 20% em DMSO (Invitrogen, P-3000MP) e incubar à temperatura ambiente por 10-30 min.
- Remover Fluo-4 solução e lavar 3 vezes com lamínulas buffer de gravação do hipocampo e incubar em temperatura ambiente por 30 min.
- Coloque a lamínula na câmara, e limpar o outro lado da lamela com o líquido de limpeza da lente.
- Coloque uma pequena gota de óleo de imersão (imersão DF TIPO Óleo de Cargille) sobre o objectivo e colocar câmara (câmara aberta por 25 mm de lamela rodada Warner Instruments) no palco do microscópio (Olympus IX71).
- Olhe para as células usando a luz de transmissão para ver como as pilhas olham, e levá-los em foco. Em seguida, iluminar as células com 488 nm de um monocromador (Polychrome V da TILL Vision) e determinar se o sinal de fluorescência de Fluo-4 é uniforme e detectável em astrócitos.
- Use EPI e TIRF iluminação para medir o cálcio nos astrócitos.
Microscopia TIRF
Resumidamente, nós usamos um microscópio Olympus IX71 equipado com uma câmera DV887DCS ixon Andor EMCCD. O controle de excitação e de aquisição de imagem é conseguido usando software TILLVision. As vigas de 454/488/515 nm Argônio (100 mW) e 442 nm de estado sólido (45 mW) lasers são combinados e controlados com um ATÉ Polyline combinador de laser, TIRF condensador porta dupla e filtro sintonizável acoustoptical e controlador (AOTF; tudo a partir de ATÉ Photonics) e alimentado em uma fibra banda larga Kineflex para a entrada no condensador TIRF. Usamos uma lente Olympus 60X 1,45 NA alcançar TIRF. O ganho da câmera é ajustada para cada astrócitos para fornecer o melhor sinal em imagens de ruído. O fundo e os princípios da microscopia TIRF foram avaliados recentemente 4, 5. A maioria dos componentes ópticos que usamos foram comprados da TILL Photonics, que agora faz parte da Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). A profundidade de penetração TIR pode ser calculada a partir das equações abaixo.
d = profundidade de penetração
n1 = índice de refração do vidro
n2 = índice de refração do celular
a = ângulo de incidência
NAi abertura = numérica de incidência
A fim de garantir o laser é alinhado de maneira ideal para TIRF achamos útil observar 100 nm fluorescentes talão (Invitrogen, F8803). Apresentamos ainda os quadros e vídeos de contas com EPI e microscopia TIRF. Quando em TIRF, observa-se um aumento dramático no sinal-ruído e os cordões de mostrar difusão browniano. Encontramo-lo útil para observar o comportamento de 100 nm com contas TIRF microscopia em uma base regular (~ uma vez por semana) para ter certeza de que TIRF ideal ocorre, ao invés de a iluminação comprometida oblíqua que ocorreria se o ângulo crítico não foram iguais a α (ver Fig. 1).
Aplicação da proteína G-agonistas do receptor acoplado
Astrócitos expressam uma variedade de Gq-coupled receptors 6, 7, incluindo receptores de glutamato metabotrópicos e receptores P2Y (agonista, ATP, ADP). Ativação desses receptores leva a aumentos significativos nos níveis de cálcio intracelular dentro de astrócitos. Por exemplo, se pode observar elevações de cálcio intracelular durante a aplicação da ATP (30 mM) para 10/08 astrócitos. Usamos uma solução rápida switcher da Warner Instruments chamado de VC-77SP sistema de perfusão Fast-Step (http://www.warneronline.com/index.cfm). Com este soluções método pode ser aplicado em menos de ~ 10 ms.
FIGURA 1. Dos desenhos animados e fotografias da imagem criada. A. mostra uma fotografia do microscópio montado em um airtable, enquanto que (B) mostra uma fotografia do conjunto do laser, os controladores e as caixas de feixe. C. Mostra uma foto do estágio do microscópio com a câmara montada para a imagem latente. Do lado esquerdo do dispositivo de perfusão rápida pode ser visto (junto com o motor de passo e tubos theta). À direita o headstage de um amplificador 200A Axopatch é visto. O cartoon esquematiza o caminho da luz no configurar e como TIRF é alcançado. O laser é focalizada sobre o plano focal posterior da lente objetiva 60X 1,45 NA e sua posição é ajustada para fora do centro, para que ela emerge para o óleo de imersão na α ângulo crítico. Neste ponto, o feixe sofre reflexão interna total e decai com uma distância λ (ver equação no texto principal) no meio de menor índice de refração. Neste caso, este é o buffer de gravação em torno do astrócitos e os astrócitos si. O resultado é excitação óptica (e, portanto, de imagem) de moléculas dentro de ~ 100 nm da membrana plasmática. No desenho da célula isso é mostrado como verde "animado" receptores de membrana, enquanto que aqueles dentro da célula ou na superfície superior da célula não está animado. Um relato completo da microscopia TIRF foi fornecido por Steyer e Almers 4.
FIGURA 2. Imagens de 100 nm grânulos fluorescentes adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. Mostra imagens EPI de um campo de visão com várias dezenas de contas de 100 nm fluorescente. O ponto de setas vermelhas para contas que se instalaram sobre a lamínula de vidro, enquanto que as setas azuis apontam para contas que estão difundindo na água. B. Mostra uma imagem TIRF do mesmo campo de visão, como mostrado na A. Neste visualizar apenas as contas aderente mostrado por setas vermelhas são visíveis. Isto porque estas se tinham estabelecido para a coverlsip de vidro e foram, portanto, dentro do campo nm ~ 100 evanescente. As contas mostrado em A por setas azuis não estão dentro desta região e são, portanto, invisível nas imagens TIRF. As parcelas inferiores mostram renderização em 3D das imagens. É claro que um grande aumento no sinal-ruído ocorre para contas dentro do campo evanescente quando observado por microscopia TIRF. De fato, para estas imagens o sinal-ruído para o PAV foi de 7,1 ± 0,6, enquanto que para TIRF foi 20 ± 0,7.
FIGURA 3. Imagens de astrócitos carregado com Fluo-4 corante indicador de cálcio adquiridos com EPI e microscopia TIRF. A. EPI imagens de um campo de visão com cinco astrócitos. B. Uma imagem TIRF do mesmo campo de visão mostrada na B. Note-se que as imagens em A e B são significativamente diferentes. Isto porque com TIRF iluminação apenas as regiões da membrana plasmática em aposição perto da lamela de vidro são gravadas. Os painéis inferiores mostram ATP evocadas transientes de cálcio intracelular fotografada com EPI e microscopia TIRF.
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Discussion
É bem estabelecido que os astrócitos mostrar elevações de cálcio intracelular. Estas ocorrem de forma espontânea, pode ser desencadeada pela atividade neuronal ou por aplicação de agonistas para ativar receptores na superfície de astrócitos 11. Uma questão importante e controversa é se astrócitos elevações de cálcio intracelular pode desencadear a liberação de moléculas de sinalização que ativam os receptores nos neurônios 11, 12. Este é controverso, porque tem havido evidências a favor e contra esta visão, como destacado nas revisões pela Haydon 7, 13 e 11 laboratórios de McCarthy. Com base em nossa recente imagem do cérebro fatia e dados de eletrofisiologia, argumentamos que uma melhor compreensão da dinâmica e precisa de cálcio astrócitos é necessária antes de experimentos conduzidos nova hipótese pode ser projetado para determinar como os neurônios astrócitos impacto 14. Neste artigo apresentamos vídeo um método simples para a imagem perto da membrana plasmática e global alterações de cálcio intracelular quase simultaneamente em astrócitos em cultura. Uma exigência inevitável técnicas de microscopia TIRF é que as células cultivadas têm de ser usadas porque elas aderem a uma lamela de vidro dentro da profundidade de campo evanescente 3. É interessante notar que os astrócitos em cultura mudar seus perfis de expressão gênica quando comparados aos in vivo 15, e por isso esta ressalva deve ser considerada aquando da execução deste método. Com este aspecto em mente, contudo, o método simples que permite que um relatório para a imagem e quantificar perto membrana plasmática e alterações globais de cálcio intracelular quase simultaneamente. A continuação da aplicação da abordagem de astrócitos mantém a promessa de fornecer dados precisos sobre alterações de cálcio intracelular, perto da membrana plasmática de astrócitos. A disponibilidade de tais dados quantitativos serão úteis para o completo entendimento da biologia astrócitos.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Memorial Uehara do Japão (a ES), bem como a Fundação Whitehall, do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame e um Stein-Oppenheimer Award Endowment (a BSK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
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