Мы опишем, как измерить возле мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в культуре астроцитов использованием полного внутреннего отражения и epifluorescence микроскопии.
Мозг содержит глиальные клетки. Астроциты, типа глиальных клеток, уже давно известно, обеспечивают пассивную вспомогательную роль для нейронов. Тем не менее, все больше данных о том, что астроциты также могут активно участвовать в функции мозга с помощью функциональной взаимодействия с нейронами. Однако, многие фундаментальные аспекты астроцитов биологии остаются спорными, неясными и / или экспериментально неизученными. Одним из важных вопросов является динамика внутриклеточного кальция в переходных астроцитов. Это важно, поскольку кальций хорошо известна как важный вторичный мессенджер и потому, что было предложено, что астроциты высотах кальция может вызвать выпуск передатчиков из астроцитов. Тем не менее, не было никакой детальной или удовлетворения описание около кальция плазматической мембраны сигнализации в астроциты. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным инструментом для анализа физиологически соответствующих сигнальных событий в течение приблизительно 100 нм плазматической мембраны живых клеток. Здесь мы используем TIRF микроскопии и описывают, как монитор вблизи плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее уточнение и систематическое применение этого подхода есть потенциал, чтобы сообщить о точных деталях астроцитов сигнализации кальция. Детальное понимание астроцитов динамики кальция могут служить основой для понимания, если, как, когда и почему астроцитов и нейронов проходят кальций-зависимых функциональных взаимодействий.
Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов 11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклет…
Эта работа была поддержана Уэхара Мемориальный фонд Японии (Е. С.), а также Уайтхолл Фонд Национального института неврологических расстройств и инсульта и Штайн-Оппенгеймера фонда премии (для БСК).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |