प्लाज्मा और astrocytes में झिल्ली ग्लोबल intracellular कैल्शियम गतिशीलता के पास माप
Summary
हम वर्णन करते हैं और सभ्य astrocytes में कुल आंतरिक प्रतिबिंब और epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग झिल्ली वैश्विक intracellular कैल्शियम गतिशीलता के पास कैसे को मापने के लिए.
Abstract
मस्तिष्क glial कोशिकाओं शामिल है. Astrocytes, glial सेल का एक प्रकार है, लंबे समय के लिए न्यूरॉन्स के लिए एक निष्क्रिय सहायक भूमिका प्रदान ज्ञात किया गया है है. हालांकि, बढ़ती सबूत से पता चलता है कि astrocytes को भी सक्रिय रूप से न्यूरॉन्स के साथ कार्यात्मक बातचीत के माध्यम से मस्तिष्क समारोह में भाग ले सकते हैं. हालांकि, astrocyte जीव विज्ञान के कई मौलिक पहलुओं विवादास्पद स्पष्ट नहीं है, और / या प्रयोगात्मक बेरोज़गार रहते हैं. एक महत्वपूर्ण मुद्दा astrocytes में intracellular कैल्शियम यात्रियों की गतिशीलता है. यह प्रासंगिक है क्योंकि कैल्शियम एक महत्वपूर्ण दूसरा दूत के रूप में अच्छी तरह से स्थापित है और क्योंकि यह प्रस्ताव किया गया है कि astrocyte कैल्शियम उन्नयन astrocytes से ट्रांसमीटरों की रिहाई को ट्रिगर कर सकते हैं. हालांकि, वहाँ के पास प्लाज्मा झिल्ली astrocytes में संकेत कैल्शियम के किसी भी विस्तृत या संतोषजनक वर्णन नहीं किया गया है. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के बारे में 100 एनएम के भीतर physiologically प्रासंगिक संकेत घटनाओं का विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यहाँ, हम TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें और वर्णन कैसे प्लाज्मा झिल्ली और वैश्विक intracellular कैल्शियम की गतिशीलता के पास पर नजर रखने के लिए लगभग एक साथ. आगे शोधन और इस दृष्टिकोण के व्यवस्थित आवेदन astrocyte संकेत कैल्शियम की सटीक जानकारी के बारे में सूचित करने की क्षमता है. Astrocyte कैल्शियम की गतिशीलता का एक विस्तृत समझ एक आधार प्रदान करते हैं अगर, कैसे समझते हैं, कब और क्यों astrocytes और न्यूरॉन्स कैल्शियम पर निर्भर कार्यात्मक बातचीत से गुजरना सकता है.
Protocol
Discussion
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि astrocytes intracellular कैल्शियम उन्नयन प्रदर्शन. ये सहज होते हैं, neuronal गतिविधि के द्वारा या agonists के आवेदन astrocyte 11 सतह पर रिसेप्टर्स सक्रिय द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण और विवादास?…
Acknowledgements
यह काम जापान के Uehara मेमोरियल फाउंडेशन (ते के लिए) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्हाइटहॉल फाउंडेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्नायविक विकारों और स्ट्रोक और एक स्टीन ओप्पेन्हेइमेर बंदोबस्ती पुरस्कार (BSK के लिए) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
