Summary
אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.
Abstract
המוח מכיל ותאי גלייה. האסטרוציטים, סוג של תא גליה, כבר מזמן ידוע לספק תפקיד תומכת פסיבית נוירונים. עם זאת, הראיות עולה כי הגדלת האסטרוציטים יכולים גם להשתתף באופן פעיל תפקוד המוח דרך אינטראקציות פונקציונלי עם הנוירונים. עם זאת, היבטים בסיסיים רבים של הביולוגיה astrocyte נותרו שנויים במחלוקת, לא ברור ו / או נחקרו בניסוי. נושא אחד חשוב בדינמיקה של הארעיים סידן תאיים ב האסטרוציטים. זה רלוונטי כי סידן הוא הקים גם שליח שנייה חשוב כי זה הוצע כי הגבהים סידן astrocyte יכול לעורר את שחרורו של משדרי של האסטרוציטים. עם זאת, לא היתה כל תיאור מפורט או מספקת של סידן קרום ליד הפלזמה איתות האסטרוציטים. סך הקרינה השתקפות פנימית (TIRF) מיקרוסקופיה הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח אירועים איתות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתוך כ 100 ננומטר של קרום הפלזמה של תאים חיים. כאן, אנו משתמשים במיקרוסקופ TIRF ולתאר כיצד לפקח ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. חידוד נוסף יישום שיטתי של גישה זו יש פוטנציאל להודיע על פרטים מדויקים של איתות סידן astrocyte. הבנה מפורטת של הדינמיקה סידן astrocyte עלול לספק בסיס להבנה אם, איך, מתי ולמה האסטרוציטים ונוירונים לעבור סידן תלויי אינטראקציות תפקודית.
Protocol
ניסיונית נהלים
הליך הניסוי מורכב משני חלקים מרכזיים המתוארים בצורה צעד חכם למטה.
חלק 1: הכנת לתרבויות ASTROCYTE בהיפוקמפוס
בקצרה, מעורבים ההיפוקמפוס astrocyte-נוירון תרבויות הוכנו באמצעות פרוטוקול מבוסס היטב 1,2,3. אנו אופטימיזציה הליך להניב האסטרוציטים תרבותי בריא. כל הנהלים המפורטים להלן אמור להתבצע בסביבה סטרילית כמו מכסה המנוע זרימה למינרית.
הכנת coverslips
- 22 מ"מ coverslips (VWR, 48380-068)
- Poly-D-ליזין (PDL, סיגמה P0899), aliquots (1 מ"ג / מ"ל)
- Laminin aliquots (20 מיקרוגרם / מ"ל): להוסיף 49 מ"ל של מים סטריליים עד 1 מ"ג / מ"ל פתרון laminin (Sigma L2020), לעשות aliquots 1.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C
- ממיסים PDL במים סטריליים (50 מיקרוגרם / מ"ל)
- החיטוי coverslips, לשטוף עם מים סטריליים במקום ב PDL (20 מ"ל עבור 100 coverslips). השאירו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- החלף PDL עם מים סטריליים (3 שוטף נרחב). לאחר מכן לייבש את coverslips ולאחסן ב 4 ° C.
- יום לפני ציפוי האסטרוציטים, coverslips המקום היחיד בבאר סטרילי בצלחת 6-באר (Multiwell Flat-Bottom צלחות עם מכסים, סטרילי מ BD Bioscience). שימי 400 μl של laminin על coverslip כל דגירה לילה, בחממה, כדי למנוע אידוי.
בתור
Dissection התקשורת:
- 500 מ"ל מלח מאוזן ארל של פתרון (EBSS) (1X), נוזל (Invitrogen, 14155-063)
- 5 מ"ל HEPES פתרון (Sigma, H0887)
בהיפוקמפוס התקשורת:
- 412.5 מ"ל בינוני Essential Minimum (מ) (1X), הנוזל מכיל מלחים של ארל, אך לא אדום L-גלוטמין או פנול (Invitrogen, 51200-038)
- 10 מ"ל גלוקוז (Sigma, D-(+), גלוקוז anhydrous SIGMA ULTRA G7528) 1 M ב ממ
- 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
- Pyruvate 5 מ"ל נתרן פתרון (Sigma, S8636)
- 12.5 מ"ל HEPES פתרון 1 M (Sigma, H0887)
- 5 מ"ל N-2 מוסף (100x), נוזל (Invitrogen, 17502-048)
- 50 מ"ל סרום סוס, חום מומת (Invitrogen, 26050-088)
Papain פתרון:
- הוסף 5 מ"ל של התקשורת לנתיחה לתוך בקבוקון PAPAIN-022 וורטינגטון (LK003178; הריכוז הסופי, 20 U / ml) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- לערוף גורים בני חולדה P1 (בדרך כלל 2 גורים) בעקבות הנחיות בדקה ואושרה על ידי תקנות לאומיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש.
- הסרה של עור הגולגולת והמוח מקום בצלחת פטרי מלאות התקשורת לנתיחה קר.
- הוסר קרומי המוח, לנתח את שתי ההמיספרות ו לנתח hippocampi.
- קוצצים את hippocampi אל ~ חתיכות 1x1 מ"מ לעכל בפתרון papain על 37 מעלות צלזיוס במשך 11-13 דקות.
- לאחר פיסות הרקמה התיישבו, להסיר בזהירות papain להוסיף 5 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס כדי להסיר כל עקבות של האנזים. חזור על שלב זה resuspend במדיום בהיפוקמפוס (2 מ"ל).
- Triturate התאים ~ 5 פעמים עד שאין גושים שמאל, עם שלושה להבה מלוטש pipettes של טרחנים קטנים יותר ויותר (1000 מיקרומטר, 500 מיקרומטר ו ~ ~ 300 מיקרומטר).
- Triturated פעם אחת, להעביר את התאים דרך מסננת תא (גודל הנקבוביות, 70 מיקרומטר, BD Bioscience). ספירת התאים μl 10 ההשעיה. כוון את עוצמת הקול של המדיום בהיפוקמפוס כדי שיהיה 400,000 תאים / מ"ל.
- לשאוב את laminin coverslips, ולפני מכסה את יכולה יבש, 200 צלחת μl של ההשעיה תא לכל coverslip.
- עזוב אותם לצרף דקות 60 בחממה, ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של מדיום בהיפוקמפוס בכל טוב.
- למחרת, לשאוב בינוני בהיפוקמפוס הישן כדי להסיר תאים מתים ופסולת ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום מראש חימם בהיפוקמפוס טריים.
תחזוקה
Neurobasal התקשורת:
- 500 מ"ל neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 מ"ל B27 בסרום תוספת חינם (Invitrogen, 17504-044)
- 5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-122)
- 1.25 מ"ל L-גלוטמין (Invitrogen, 25030-149)
הזנת ה-astrocyte נוירון תרבויות פעמיים בשבוע עם המדיום neurobasal, החל ארבעה ימים לאחר ציפוי. Preincubate התקשורת על 30 דקות בחממה בבקבוק מאוורר לאזן את הטמפרטורה ו-CO 2.
חלק 2: הדמיה סידן
הקלטה חיץ בהיפוקמפוס: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.8 mM MgCl 2, 10 mM D-גלוקוז, HEPES 10 מ"מ (כל כימיקלים Sigma) 7.4 pH (מנוכה עם NaOH).
טוען אינדיקטור צבע סידן לתוך האסטרוציטים
- מניחים את התרבות בבאר בצלחת 6-טוב מלא 2 חיץ מ"ל בהיפוקמפוס הקלטה המכיל 2.5 מיקרומטר Fluo-4, בבוקר (Invitrogen, F-14217) ו Pluronic 0.05% ® פתרון ה-F-127 20% DMSO (Invitrogen, P-3000MP) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10-30 דקות.
- הסר Fluo-4 פתרון ולשטוף coverslips 3 פעמים עם חיץ הקלטה דגירה בהיפוקמפוס בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- מניחים את coverslip על החדר, לנקות את הצד השני של coverslip עם נוזל לניקוי עדשות.
- לשים טיפה אחת קטנה של שמן טבילה (שמן טבילה TYPE DF מ Cargille) על המטרה ולשים תא (תא פתוח coverslip 25 מ"מ עגול מבית וורנר מכשירים) על הבמה של המיקרוסקופ (אולימפוס IX71).
- תראו את התאים באמצעות שידור אור כדי לראות כיצד התאים נראים, ולקבל אותם אל המוקד. ואז להאיר את התאים עם 488 ננומטר מתוך monochromator (צבעוני V מ עד Vision) ולקבוע אם האות פלואורסצנציה של Fluo-4 הוא אחיד לזיהוי האסטרוציטים.
- השתמש EPI ו TIRF תאורה למדוד סידן האסטרוציטים.
TIRF מיקרוסקופיה
בקצרה, אנו משתמשים במיקרוסקופ IX71 אולימפוס מצויד במצלמה iXon אנדור EMCCD DV887DCS. השליטה של עירור ורכישת התמונה מושגת באמצעות תוכנת TILLVision. הקורות של 454/488/515 ננומטר ארגון (100 mW) ו - 442 ננומטר של מצב מוצק (45 mW) לייזרים משולבים ומבוקר עם עד Polyline לייזר combiner, מעבה TIRF נמל כפול ולסנן tuneable acoustoptical הבקר (AOTF; כל מ עד Photonics) ו fed לתוך סיב הלהקה Kineflex רחבה לכניסה הקבל TIRF. אנו משתמשים 60x עדשת אולימפוס 1.45 NA להשיג TIRF. לזכות המצלמה מותאמת עבור כל astrocyte לספק את האות הטוב ביותר לתמונות רעש. הרקע והעקרונות של מיקרוסקופיה TIRF נבדקו לאחרונה 4, 5. מרבית הרכיבים האופטיים אנו משתמשים נרכשו מ עד Photonics, המהווה כיום חלק Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). עומק החדירה TIR ניתן לחשב משוואות להלן.
d = חדירה לעומק
n1 = מקדם השבירה של זכוכית
= n2 מקדם השבירה של התא
זווית = של שכיחות
נאי = הצמצם המספרי של שכיחות
על מנת להבטיח את הלייזר מיושר בצורה אופטימלית עבור TIRF אנו מוצאים את זה שימושי כדי לצפות 100 ננומטר פלורסנט חרוז (Invitrogen, F8803). אנו מציגים עדיין מסגרות וקטעי וידאו של חרוזים עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. כאשר ב TIRF, אחד מציין עלייה דרמטית האות לרעש-to-וחרוזים התצוגה דיפוזיה בראונית. אנחנו מוצאים את זה שימושי כדי לבחון את התנהגותם של 100 ננומטר חרוזים עם מיקרוסקופיה TIRF על בסיס קבוע (~ פעם בשבוע) כדי להיות בטוח כי TIRF אופטימלי מתרחש, ולא בתאורה אלכסונית נפגעת כי היה להתרחש אם זווית ביקורתית לא היו שווים α (ראה איור 1).
יישום ה-G-חלבון אגוניסטים לקולטן מצמידים
האסטרוציטים להביע מגוון של GQ מצמידים קולטנים 6, 7 כולל קולטני גלוטמט metabotropic ואת הקולטנים P2Y (אגוניסט, ATP, ADP). ההפעלה של רצפטורים אלו מוביל עליות משמעותיות רמות הסידן בתוך האסטרוציטים תאיים. למשל, אפשר בקלות להבחין הגבהים סידן תאיים במהלך היישום של ה-ATP (30 מיקרומטר) ל 8-10 האסטרוציטים. אנו משתמשים פתרון מהיר switcher מ וורנר מכשירים שנקרא VC-77SP Fast-Step System זלוף (http://www.warneronline.com/index.cfm). עם פתרונות בשיטה זו ניתן ליישם בתוך פחות מ ~ 10 מילישניות.
באיור 1. קריקטורה ותצלומים של הדמיה להגדיר. א מציג תצלום של המיקרוסקופ רכוב על airtable, ואילו (ב) מראה תמונה של האסיפה לייזר, בקרי ותיבות הקורה. ג מציג תמונה של הבמה מיקרוסקופ עם תא רכוב הדמיה. משמאל המכשיר זלוף מהיר ניתן לראות (יחד עם מנוע צעד צינורות תטא). מימין headstage של מגבר Axopatch 200A נתפסת. הקריקטורה schematizes נתיב האור להגדיר את מעלה כמה TIRF מושגת. הלייזר מתמקדת במישור המוקד האחורי של העדשה 60x NA 1.45 אובייקטיבי מעמדה מותאם מחוץ למרכז כך עולה לתוך השמן טבילה ב α זווית ביקורתית. בשלב זה קרן סובל השתקפות פנימית מוחלטת דועך עם λ מרחק (ראו משוואה בטקסט הראשי) לתוך המדיום של מקדם השבירה נמוך. במקרה זה מדובר החיץ שמסביב הקלטה האסטרוציטים ואת האסטרוציטים עצמם. התוצאה היא עירור אופטי (ובכך הדמיה) של מולקולות בתוך ~ 100 ננומטר של הממברנה הפלסמטית. בקריקטורה של התא הזה מוצג ירוק קולטנים "נרגש" קרום, ואילו אלה בתוך התא או על המשטח העליון של התא הם לא מתרגשים. החשבון המלא של מיקרוסקופיה TIRF סופק על ידי Steyer ו Almers 4.
איור 2. תמונות של 100 ננומטר חרוזי ניאון רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א מציג תמונות EPI של שדה הראייה עם כמה עשרות חרוזי 100 ננומטר ניאון. נקודת החצים האדומים כדי חרוזים כי יש התיישבו על coverslip הזכוכית, בעוד ראשי חץ כחול הצבע חרוזים כי הם לשדר במים. ב 'מציג תמונה TIRF של אותו שדה הראייה כפי שמוצג א בתצוגה זו רק את החרוזים חסיד שמוצג על ידי החיצים האדומים הם גלויים. הסיבה לכך היא כי אלה התיישבו על coverlsip הזכוכית היו אפוא בתחום 100 ננומטר ~ חלוף. חרוזים שמוצג על ידי החצים הכחולים אינם בתוך האזור הזה הם בלתי נראים אפוא את התמונות TIRF. מגרשים התחתון להראות טיוח 3D של התמונות. ברור כי עלייה גדולה האות לרעש-to-מתרחש עבור חרוזים בתחום חלוף כאשר נצפתה על ידי מיקרוסקופ TIRF. למעשה, עבור תמונות אלו את האות לרעש עבור EPI היה 7.1 ± 0.6, ואילו TIRF זה היה 20 ± 0.7.
איור 3. תמונות של האסטרוציטים עמוסה Fluo-4 צבע סידן אינדיקטור רכשה עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF. א EPI תמונות של שדה הראייה עם חמישה האסטרוציטים. ב התמונה TIRF של אותו שדה הראייה שמוצג ב הערה כי תמונות A ו-B הם שונים באופן משמעותי. הסיבה לכך היא כי עם TIRF תאורה רק הממברנה הפלסמטית האזורים הפרד קרוב coverslip הזכוכית הם צילמו. לוחות נמוך להראות ATP-עורר הארעיים סידן תוך תאי צילמו עם EPI ו מיקרוסקופיה TIRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים להציג הגבהים סידן תוך תאי. אלה מתרחשות באופן ספונטני, יכול להיות מופעלות על ידי הפעילות העצבית או על ידי יישום של אגוניסטים כדי להפעיל את הקולטנים על פני השטח astrocyte 11. נושא אחד חשוב במחלוקת היא האם astrocyte הגבהים סידן תוך תאי יכול לעורר את שחרורו של מולקולות איתות כי הפעלת הקולטנים על נוירונים 11, 12. זה שנוי במחלוקת כי יש כבר ראיות בעד ונגד השקפה זו, מודגשת כפי שהיידון 7, 13 ו - 11 מעבדות מקארתי בסקירות. על סמך האחרונות הדמיה המוח שלנו פרוסה ונתונים electrophysiology אנו טענו כי הבנה טובה יותר ומדויקת של הדינמיקה astrocyte סידן נחוץ לפני ניסויים השערה חדשה מונע יכול להיות מתוכנן כדי לקבוע כיצד האסטרוציטים נוירונים השפעה 14. במאמר זה אנו מציגים וידאו שיטה פשוטה לתמונה ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית שינויים סידן תוך תאי כמעט בו זמנית האסטרוציטים תרבותי. דרישה טכנית בלתי נמנעת של מיקרוסקופיה TIRF היא כי תאים בתרבית צריך לשמש כי הם דבקים coverslip זכוכית בתוך עומק השדה חלוף 3. ראוי לציין כי האסטרוציטים בתרבות לשינוי בביטוי הגנים שלהם פרופילים בהשוואה לאלו in vivo 15, וכך זה אזהרה יש לשקול בעת יישום שיטה זו. עם שיקול זה בחשבון אולם שיטה פשוטה אנו מדווחים מרשה אחד תמונת ולכמת ליד הממברנה הפלסמטית והעולמית שינויים סידן תוך תאי כמעט בו זמנית. יישום נוסף של הגישה את האסטרוציטים מקיים את ההבטחה לספק נתונים מדויקים על השינויים סידן תוך תאי ליד הממברנה הפלסמטית של האסטרוציטים. זמינותם של נתונים כמותיים כזה יהיה שימושי עבור הבנה מלאה של הביולוגיה astrocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן הזיכרון Uehara של יפן (כדי ES) וכן קרן וייטהול, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ ואת פרס שטיין אופנהיימר הקרן (עד BSK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
