Summary
我们描述了如何来衡量膜和全球培养的星形胶质细胞，利用全内反射和epifluorescence显微镜细胞内钙离子动力学附近。
Abstract
大脑含有神经胶质细胞。星形胶质细胞，神经胶质细胞类型，长期被称为神经元提供了一个被动的支撑作用。然而，越来越多的证据表明，星形胶质细胞可能也积极参与脑功能，通过与神经元的功能的相互作用。然而，星形胶质细胞生物学的许多基本方面仍然争议，职责不清和/或实验未开发。其中一个重要的问题是星形胶质细胞内钙瞬变的动态。这是有关的，因为钙是完善作为一项重要的第二信使，因为它已被提出，星形胶质细胞钙升高可以触发从星形胶质细胞释放发射机。然而，还没有任何近质膜钙信号在星形胶质细胞的详细或令人满意的描述。全内反射荧光显微镜（TIRF）是一个强大的工具来分析有关生理信号事件，约100纳米的活细胞质膜内。在这里，我们使用TIRF显微镜和描述如何几乎同时监测到附近的细胞膜和全球细胞内钙的动态。这种方法的进一步完善和系统应用的潜力，以了解星形胶质细胞钙信号的精确细节。一个星形胶质细胞钙动力学的详细了解可能会提供一个基础，了解是否，如何，何时和为什么星形胶质细胞和神经元接受钙依赖性的功能上的相互作用。
Protocol
实验步骤
实验过程由两个关键部件，是明智的方式在一个步骤如下所述。
第1部分：准备海马星形胶质细胞的培养
简单地说，混合海马星形胶质细胞神经元的文化准备使用一个完善的协议1,2,3。我们优化的过程，产生健康的培养的星形胶质细胞。下面列出的所有程序应在无菌层流罩，如环境进行。
准备盖玻片
- 22毫米的盖玻片（VWR，48380-068）
- 聚- D -赖氨酸（PDL，Sigma公司P0899），分装（1毫克/毫升）
- 层粘连蛋白等分（20微克/毫升）：1毫克/毫升层粘连蛋白溶液（Sigma公司L2020），添加49毫升无菌水1.2毫升分装和储存在-20 ° C
- 在无菌水溶解的PDL（50微克/毫升）
- 高压灭菌的盖玻片，用无菌水，并在客运专线（100盖玻片20毫升）冲洗。在室温下离开过夜。
- 用无菌水（3广泛洗）替换的PDL。然后干在4盖玻片和存储° C。
- 一天前在无菌以及电镀的星形胶质细胞，个别地方盖玻片的6孔板（多孔平底板有盖无菌从屋宇署生物科学）。每个盖玻片放入400μL层粘连蛋白，在培养箱中孵育过夜，以避免蒸发。
解剖
夹层媒体：
- 500毫升厄尔的平衡盐溶液（EBSS）（1X），液体（Invitrogen公司，14155-063）
- 5毫升HEPES溶液（Sigma公司，H0887）
海马媒体：
- 412.5毫升的最低限度的基本培养基（MEM）（1X），液体中含有Earle的盐，但没有L -谷氨酰胺或酚红（Invitrogen公司，51200-038）
- 10毫升的葡萄糖（Sigma公司，D -（+） - 葡萄糖无水SIGMA超G7528）在MEM 1米
- 5 ml青霉素，链霉素（Invitrogen公司，15140-122）
- 5毫升丙酮酸钠溶液（Sigma公司，S8636）
- 12.5毫升的HEPES溶液1 M（Sigma公司，H0887）
- 5毫升的N - 2补编（100X），液体（Invitrogen公司，17502-048）
- 50毫升马血清，热灭活（Invitrogen公司，26050-088）
木瓜蛋白酶的解决方案：
- 沃辛顿木瓜蛋白酶- 022瓶（LK003178;终浓度为20 U /毫升）中加入5毫升清扫媒体和孵育在37 ° C为60分钟。
- 杀头P1（通常为2幼仔）按照国家法规和本地机构的动物护理和使用委员会的审核和批准的准则岁的幼鼠。
- 取下的皮肤在培养皿和颅骨和地方的大脑充满了冷夹层媒体。
- 删除脑膜，解剖两个半球的解剖海马。
- 斩〜1X1毫米件和消化的木瓜蛋白酶溶液在37℃11-13分钟彗星的海马。
- 一旦组织的相继落户，取出木瓜仔细，并添加5毫升海马介质的酶中删除所有痕迹。海马液（2毫升）重复此步骤和悬浮。
- 直到有没有留下的团块逐渐变小的孔（1000微米〜500微米〜300微米）的三个火焰抛光移液器，磨碎的细胞〜5倍。
- 磨碎后，通过一个细胞过滤器（孔径70微米，BD生物科学）的细胞。计数在10μL悬浮细胞。调整海马中等音量，以有40万细胞/ ml。
- 吸过的盖玻片层粘连蛋白，前盖可以干，板每盖玻片的细胞悬液200μL。
- 他们重视孵化器在60分钟，然后加入2毫升每口井的海马中等许可。
- 第二天，吸老海马介质，去除死细胞和碎片，加2毫升预热新鲜海马中等。
维修
Neurobasal媒体：
- 500毫升neurobasal（Invitrogen公司，12348-017）
- 10毫升B27的无血清的补充（Invitrogen公司，17504-044）
- 5 ml青霉素，链霉素（Invitrogen公司，15140-122）
- 1.25毫升L -谷氨酰胺（Invitrogen公司，25030-149）
每周两次的星形胶质细胞神经元文化与neurobasal中型饲料，电镀后开始的4天。 Preincubate通风烧瓶中的孵化器约30分钟的媒体，以平衡的温度和CO 2。
第2部分：钙成像
海马记录缓冲液：氯化钠110毫米，5.4毫米氯化钾， 氯化钙 1.8毫米，0.8毫米MgCl 2的 D -葡萄糖，10毫米，10毫米的HEPES（Sigma的所有化学品），pH值7.4（用NaOH调整）。
装入星形胶质细胞钙指示剂
- 广场上海马2毫升含2.5微米荧光4，AM（Invitrogen公司的F - 14217）和0.05％聚醚®在DMSO溶液中的F - 127 20％的记录缓冲区充满了6孔板（Invitrogen公司在一个良好的文化， P - 3000MP）和孵育室温为10-30分钟。
- 删除FLUO - 4解决方案和洗盖玻片海马记录的缓冲区，并在室温30分钟的孵育3倍。
- 广场上腔盖玻片，用镜头清洁液和清洁盖玻片的另一侧。
- 的目标之一浸油的小水滴（Cargille DF型浸油）和室（华纳仪器25毫米的圆形盖玻片打开商会）放在显微镜（奥林巴斯IX71）的阶段。
- 看看使用透射光的细胞到细胞的外观，并让他们成为关注的焦点。 488纳米，然后照亮细胞从单色（多彩V，从早忙到视觉），并确定是否统一和星形胶质细胞检测荧光信号荧光4。
- 使用EPI和TIRF照明措施星形胶质细胞中的钙。
TIRF显微镜
简而言之，我们使用奥林巴斯IX71显微镜与安道尔IXON DV887DCS EMCCD相机配备。激发和图像采集控制使用TILLVision软件实现。 454/488/515 nm的氩气（100兆瓦）和442 nm的固态激光器（45兆瓦）的梁相结合，并控制与一个至折线激光合成，TIRF双端口冷凝器和acoustoptical可调谐滤波器和控制器（AOTF的;所有从直到光子）和美联储成Kineflex宽带光纤进入TIRF冷凝器。我们使用了奥林巴斯60X 1.45 NA透镜实现TIRF。摄像机的增益调整为每个星形胶质细胞提供了最佳的信号噪声的图像。 TIRF显微镜的背景和原则，最近已经审查4，5 。大部分我们所使用的光学元件均购自至光子，这是安捷伦科技公司（http://www.till-photonics.com/）的一部分。 TIR穿透深度可以从下面的公式计算。
D =穿透深度
N1 =玻璃的折射率
N2 =折射率细胞
=角的发病率
NAI =数值孔径的发病率
为了确保激光TIRF最佳对齐，我们发现它很有用，观察100 nm的荧光珠（Invitrogen公司，F8803）。我们目前还珠与EPI和TIRF显微镜的框架和录像。在TIRF，观察一个信号噪声的急剧增加和珠显示布朗扩散。我们发现它很有用的100纳米珠定期（每周）〜一次，以确保最佳TIRF发生，而不是损害斜照明即会发生与TIRF显微镜观察的行为，如果不等于临界角α（见图1）。
G蛋白偶联受体激动剂的应用
星形胶质细胞表达的Gq蛋白偶联受体6，7，包括多种代谢型谷氨酸受体和P2Y受体（受体激动剂，ATP，ADP） 。这些受体的激活，导致内星形胶质细胞在细胞内钙离子水平的显着增加。例如，人们可以很容易地在ATP（30微米），以星形胶质细胞8-10中的应用观察细胞内钙升高。我们使用一个快速的解决方案的切换华纳仪器称为VC - 77SP快速步灌流系统（http://www.warneronline.com/index.cfm）。用这种方法解决方案可以应用在小于10毫秒。
图1：卡通和成像的照片集。答：显示一个安装在显微镜上airtable的照片，而（B）显示激光器组件，控制器和梁框的照片。 C.显示安装成像腔显微镜阶段的照片。在左侧的快速灌注设备（与步进电机和θ管）可以看出。看到右侧的Axopatch 200A放大器的探头。卡通schematizes设置光通路，以及如何TIRF是实现。激光是集中在1.45 NA的60X物镜，它的立场后焦平面调整偏离中心，并使其出现在临界角α浸油。此时梁患有低折射率的介质，从全内反射和衰减与距离λ（见正文方程）。在这种情况下，这是录音缓冲区周围的星形胶质细胞和星形胶质细胞本身。结果是〜100 nm的质膜内的分子激发光（因而成像）。在动画片的细胞，这是显示为绿色的“兴奋”的膜受体，而在细胞内或细胞的顶面，这些都不是兴奋。已经提供了一个充分考虑TIRF显微镜Steyer和Almers 4。
图2。EPI和TIRF显微镜获得的100 nm的荧光珠的图片。 A. EPI图像显示领域的几十个100 nm的荧光珠。红色箭头指向纷纷落户到玻璃盖玻片，而蓝色箭头指向在水中扩散的珠子珠。 B. TIRF图像显示了在相同的视野，在此视图中显示只在A是可见的红色箭头所示的贴壁珠的。这是，因为这些已经解决了的玻璃coverlsip上，并因此在〜100 nm的渐逝场。蓝色箭头所示的珠子是不是这个区域内，因此在TIRF图像看不见的。下图显示的图像的3D渲染。它是明确的大量增加，在信号噪声珠渐逝领域内发生时TIRF显微镜观察。事实上，这些图像的EPI信号与噪声为7.1 ± 0.6，而TIRF为20 ± 0.7。
图3。荧光钙指标与EPI和TIRF显微镜收购的染料加载星形胶质细胞的图像。 A.五个星形胶质细胞领域的扩大免疫规划的图像。 B.一个在注意，在图像A和B有明显的不同图中的同一领域的TIRF形象。这是因为只有血浆膜紧密并置到玻璃盖玻片地区TIRF照明成像。较低的面板显示的ATP诱发细胞内钙瞬变与EPI和TIRF显微镜成像。
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Discussion
它是行之有效的，星形胶质细胞显示细胞内钙升高。这些自发地发生，可引发神经元的活动，或通过受体激动剂的应用程序激活星形胶质细胞表面的受体11。其中一个重要的和有争议的问题是是否星形胶质细胞内钙升高可触发释放信号分子，激活受体对神经元的11，12。因为有支持和反对这种观点的证据， 海顿7，第13和麦卡锡 11实验室在评论强调，这是有争议的。根据我们最近的脑切片成像和电生理数据，我们认为一个更好的星形胶质细胞钙动力学和准确的理解之前，需要新的假说驱动的，可以设计实验，以确定如何星形胶质细胞影响神经元的14。在这个视频文章中，我们提出了一个简单的方法来靠近质膜的形象和全球培养的星形胶质细胞的细胞内钙离子的变化几乎同时。 TIRF显微镜的一个不可回避的技术要求，培养的细胞，必须使用，因为他们坚持在渐逝景深 3的玻璃盖玻片。这是值得注意的文化星形胶质细胞的基因表达谱的变化相比，那些在体内15时，所以这个警告时，应考虑实施这种方法。然而考虑到这一点的考虑简单的方法，我们报告并允许一个形象和附近的质膜和全球性的细胞内钙离子的变化的量化几乎同时发生。该方法的进一步应用到星形胶质细胞拥有提供准确的数据，对附近的星形胶质细胞质膜细胞内钙离子的变化的承诺。这些定量数据的可用性将星形胶质细胞生物学的完整的理解非常有用。
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Acknowledgments
这项工作是支持日本的上原纪念基金会（ES）以及白厅基金会，国立神经疾病与中风和斯坦 - 奥本海默基金会奖（BSK）。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
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