アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定
Summary
我々は内部全反射し、落射蛍光顕微鏡を用いて培養アストロサイトにおける膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くで測定する方法について説明します。
Abstract
脳は、グリア細胞が含まれています。アストロサイト、グリア細胞の種類は、神経細胞に受動的な支援する役割を提供するために長い間知られている。しかし、増加する証拠は、アストロサイトはまた、積極的に神経細胞との機能的な相互作用を介して脳機能に関与する可能性を示唆している。しかし、アストロサイト生物学の多くの基本的な側面は、議論の不明確及び/または実験的に未踏のまま。重要な問題の1つは、アストロサイトにおける細胞内カルシウムトランジェントのダイナミクスである。カルシウムが十分に重要なセカンドメッセンジャーとして確立されているため、それがアストロサイトのカルシウムの上昇は、アストロサイトからの伝達物質の遊離を引き起こすことができることが提案されているので、これは関連しています。しかし、アストロサイトのシグナル伝達の近くに、細胞膜のカルシウムの任意の詳細や満足な説明がされていません。全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡は、生きた細胞の原形質膜の約100nm内で生理学的に関連するシグナル伝達事象を分析するための強力なツールです。ここでは、全反射顕微鏡を使用し、ほぼ同時に形質膜とグローバルな細胞内カルシウム動態の近くに監視する方法について説明します。このアプローチのさらなる改良と体系的なアプリケーションは、アストロサイトのカルシウムシグナル伝達の正確な詳細をお知らせする可能性があります。アストロサイトのカルシウム動態の詳細な理解は、次の場合に、どのように、いつ、なぜアストロサイトとニューロンはカルシウム依存性の機能的相互作用を受ける理解する基礎を提供することがあります。
Protocol
実験手順実験手順は以下のステップ賢明な方法で説明されている2つのキーの部分で構成されています。 パート1：はPREPARING海馬アストロサイトの培養簡単に言えば、混合海馬アストロサイトニューロン培養物を、十分に確立されたプロトコル1,2,3を用いて調製した。我々は、健全な培養アストロサイトを生成する手順を最適?…
Discussion
それは、アストロサイトは細胞内カルシウムの上昇を表示することが十分に確立されている。これらは自発的に発生する、アストロサイト表面11上の受容体を活性化するニューロンの活動によって、またはアゴニストのアプリケーションによってトリガーすることができます。一つの重要なと論争はアストロサイト細胞内カルシウムの上昇が神経細胞11、12に受容体を活性化するシグナル伝達…
Acknowledgements
この作品は、日本の財団法人上原記念生命科学財団（ESの）だけでなく、ホワイトホール財団、神経疾患や脳卒中の国立研究所とスタインハイマー基金賞（BSKまで）によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargille | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | WARNER Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | WARNER Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
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Cite This Article
Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes. J. Vis. Exp. (26), e1142, doi:10.3791/1142 (2009).