Summary
Мы опишем, как измерить возле мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в культуре астроцитов использованием полного внутреннего отражения и epifluorescence микроскопии.
Abstract
Мозг содержит глиальные клетки. Астроциты, типа глиальных клеток, уже давно известно, обеспечивают пассивную вспомогательную роль для нейронов. Тем не менее, все больше данных о том, что астроциты также могут активно участвовать в функции мозга с помощью функциональной взаимодействия с нейронами. Однако, многие фундаментальные аспекты астроцитов биологии остаются спорными, неясными и / или экспериментально неизученными. Одним из важных вопросов является динамика внутриклеточного кальция в переходных астроцитов. Это важно, поскольку кальций хорошо известна как важный вторичный мессенджер и потому, что было предложено, что астроциты высотах кальция может вызвать выпуск передатчиков из астроцитов. Тем не менее, не было никакой детальной или удовлетворения описание около кальция плазматической мембраны сигнализации в астроциты. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным инструментом для анализа физиологически соответствующих сигнальных событий в течение приблизительно 100 нм плазматической мембраны живых клеток. Здесь мы используем TIRF микроскопии и описывают, как монитор вблизи плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее уточнение и систематическое применение этого подхода есть потенциал, чтобы сообщить о точных деталях астроцитов сигнализации кальция. Детальное понимание астроцитов динамики кальция могут служить основой для понимания, если, как, когда и почему астроцитов и нейронов проходят кальций-зависимых функциональных взаимодействий.
Protocol
Экспериментальных процедур
Экспериментальная процедура состоит из двух основных частей, описанных в шаге мудрым образом ниже.
Часть 1: ПОДГОТОВКА ГИППОКАМПА астроцитов КУЛЬТУР
Короче говоря, смешанные гиппокампа астроцитов-нейрона культуры были подготовлены с использованием хорошо установленным протоколом 1,2,3. Мы оптимизировали процедуру для получения здорового культурного астроцитов. Все процедуры, перечисленные ниже, должны осуществляться в стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.
Подготовка покровных
- 22 мм покровные (VWR, 48380-068)
- Поли-D-лизин (PDL, Sigma P0899), аликвоты (1 мг / мл)
- Ламинин аликвоты (20 мкг / мл): добавить 49 мл стерильной воды до 1 мг / мл ламинин решение (Sigma L2020), убедитесь, 1,2 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C
- Растворите PDL в стерильной воде (50 мкг / мл)
- Автоклав покровные, промыть стерильной водой и поместите в PDL (20 мл на 100 покровные). Оставить при комнатной температуре в течение ночи.
- Замените PDL стерильной водой (3 обширные моет). Затем сухие покровные и хранить при температуре 4 ° C.
- Накануне покрытие астроциты, место отдельных покровных в стерильных также на 6-луночного планшета (многоямного плоским дном пластины с крышками, стерильные с BD Bioscience). Положите 400 мкл ламинин на каждом покровное и инкубировать в течение ночи, в инкубаторе, чтобы избежать испарения.
Рассечение
Препарирование СМИ:
- Сбалансированный 500 мл Эрла раствор соли (EBSS) (1X), жидкие (Invitrogen, 14155-063)
- 5 мл HEPES решение (Sigma, H0887)
Гиппокампа СМИ:
- 412,5 мл минимально необходимого среднего (MEM) (1X), жидкость содержит солей Эрла, но не L-глютамин или фенол красный (Invitrogen, 51200-038)
- 10 мл глюкозы (Sigma, D-(+)-ГЛЮКОЗЫ БЕЗВОДНЫЙ SIGMA ULTRA G7528) 1 M в MEM
- 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
- 5 мл Натрия пируват решение (Sigma, S8636)
- 12,5 мл HEPES раствор 1 М (Sigma, H0887)
- 5 мл N-2 Дополнение (100X), жидкие (Invitrogen, 17502-048)
- 50 мл лошадиной сыворотки, тепло-инактивированная (Invitrogen, 26050-088)
Папаин решение:
- Добавьте 5 мл вскрытия средств массовой информации в Уортингтон папаин-022 флакона (LK003178; конечная концентрация 20 ЕД / мл) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
- Обезглавьте крысят в возрасте P1 (обычно 2 щенка) следующие рекомендации проверены и одобрены национальными правилами и ваши местные институциональные уходу и использованию животных комитета.
- Удалить кожу и череп и мозг место в чашке Петри заполнены холодной СМИ рассечение.
- Удалены мозговых оболочек, рассекать обоих полушарий и рассекать гиппокампе.
- Чоп в гиппокампе ~ 1X1 мм кусочки и переварить в растворе папаина при 37 ° С в течение 11-13 мин.
- Как только кусочки ткани осели, удалить папаин осторожно и добавляют 5 мл гиппокампа среду, чтобы удалить все следы фермента. Повторите этот шаг и ресуспендируют в гиппокампе среде (2 мл).
- Измельченного в порошок клетки ~ 5 раз, пока Есть не сгустки слева, с тремя пламени полированный пипеток все меньшие отверстия (1000 мкм, ~ 500 мкм и ~ 300 мкм).
- После растирают, проходят клетки через ячейки сетчатого фильтра (размер пор, 70 мкм, BD Bioscience). Граф клеток в 10 мкл суспензии. Регулировка громкости гиппокампа средой, чтобы иметь 400 000 клеток / мл.
- Аспирируйте ламинин от покровных, а до крышки можно сухих, пластина 200 мкл суспензии клеток в покровное.
- Оставьте их приложить в течение 60 мин в инкубаторе, а затем добавить 2 мл гиппокампа среды на лунку.
- На следующий день, аспирации старые гиппокампа средой для удаления мертвых клеток и мусора и добавьте 2 мл подогретого свежего гиппокампа среды.
Обслуживание
Neurobasal СМИ:
- 500 мл neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 мл сыворотки B27 бесплатное приложение (Invitrogen, 17504-044)
- 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 мл L-глутамина (Invitrogen, 25030-149)
Поток астроцитов-нейрон культур два раза в неделю с neurobasal среды, начиная через четыре дня после металлизации. Preincubate СМИ около 30 минут в инкубаторе в вентилируемом колбу, чтобы уравновесить температуру и CO 2.
Часть 2: КАЛЬЦИЯ IMAGING
Гиппокампа буфера записи: 110 мМ NaCl, 5,4 мМKCl, 1,8 мМ CaCl 2, 0,8 мМ MgCl 2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES (Все химические вещества из Sigma), рН 7,4 (регулируется с NaOH).
Загрузка красителя кальция индикатор в астроциты
- Место культуры в хорошо на 6-луночный планшет заполнен 2 мл гиппокампа буфера записи, содержащей 2,5 мкМ Fluo-4, А. М. (Invitrogen, F-14217) и 0,05% Pluronic ® F-127 20% раствор в ДМСО (Invitrogen, P-3000MP) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-30 мин.
- Удалить Fluo-4 решения и мыть покровные 3 раза гиппокампа буфера записи и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Место покровное на камеру, а чистая другой стороне покровного с объективом жидкости очистки.
- Положите одну каплю иммерсионного масла (погружение нефти типа DF с Cargille) на цель и поставить камеры (с открытой камерой на 25 мм выстрел покровное от Warner Instruments) на столик микроскопа (Olympus IX71).
- Посмотрите на клетки, используя пропускание света, чтобы увидеть, как выглядят клетки, и получить их в фокусе. Затем освещения клеток с 488 нм от монохроматора (полихромные V от до Vision) и определить, если сигнал флуоресценции от Fluo-4 является однородным и обнаруживается в астроциты.
- Используйте РПИ и TIRF освещения для измерения кальция в астроциты.
TIRF микроскопии
Одним словом, мы используем Olympus IX71 Микроскоп оснащен камерой Andor IXON DV887DCS EMCCD. Контроль возбуждения и захвата изображений достигается с помощью TILLVision программного обеспечения. Пучки 454/488/515 нм аргон (100 мВт) и 442 нм твердом состоянии (45 мВт) лазеры и управляться с ДО Polyline лазерной комбайнера, TIRF двойной конденсатор порт и acoustoptical настраиваемый фильтр и контроллер (AOTF, все из ДО Photonics) и подается в Kineflex широкие волокна полосы для вступления в конденсаторе TIRF. Мы используем Olympus 60X 1,45 NA линз для достижения TIRF. Усиление камеры настраивается для каждого астроцитов, чтобы обеспечить лучший сигнал-шум изображения. Фон и принципы микроскопии TIRF были недавно рассмотрели 4, 5. Большинство оптических компонентов мы используем были приобретены у ДО Photonics, которая сейчас является частью компании Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Глубина проникновения МДП может быть рассчитана по уравнениям ниже.
D = глубина проникновения
n1 = преломления стекла
n2 = преломления клеточных
= угол падения
NAi = числовой апертурой падения
В целях обеспечения лазерной выравнивается оптимально для TIRF мы находим его полезным для наблюдения 100 нм флуоресцентного шарик (Invitrogen, F8803). Мы представляем отдельные кадры и видео из бисера с РПИ и TIRF микроскопии. Когда в TIRF, наблюдается резкое увеличение сигнал-шум и бисером дисплей броуновской диффузии. Мы находим его полезным для наблюдения за поведением 100 нм бисер с TIRF микроскопии на регулярной основе (~ раз в неделю), чтобы убедиться, что оптимальное TIRF происходит, а не угрозу косом освещении, что может произойти, если критический угол не были равны α (см. рис 1).
Применение G-белком рецептор агонистов связаны
Астроциты выражать различные Gq-связанных рецепторов, 6, 7, включая метаботропных рецепторы глутамата и P2Y рецепторов (агонист, АТФ, АДФ). Активация этих рецепторов приводит к значительному увеличению внутриклеточного уровня кальция в астроциты. Например, нетрудно заметить внутриклеточного кальция высотах во время применения СПС (30 мкМ) на астроциты 8-10. Мы используем быстрое решение переключатель с Warner инструменты называют VC-77SP Быстро Шаг перфузии системы (http://www.warneronline.com/index.cfm). С помощью этого метода решения могут быть применены в менее ~ 10 мс.
Рисунок 1. Мультфильм и фотографии изображений создана. А. Показывает фотографию Микроскоп установлен на airtable, в то время (B) показывает фотографию лазерной установки, контроллеры и балки коробки. С. Показывает фотографию столике микроскопа с камеры установлены для работы с изображениями. На левом быстро устройство перфузии можно увидеть (наряду с шаговым двигателем и тета трубки). На правом headstage из усилителя Axopatch 200A не наблюдается. Мультфильм схематизирует пути света в настройке и как TМДФ достигается. Лазерной сосредоточено на задней фокальной плоскости 60X 1,45 NA объектива и его положение регулируется от центра так, что он возникает в иммерсионного масла в критический угол α. В этот момент луч испытывает полное внутреннее отражение и убывает с расстоянием λ (см. уравнение в основной текст) в среду меньшим показателем преломления. В данном случае это буфер записи окружающие астроциты и астроциты себя. В результате оптического возбуждения (и, следовательно, изображения) молекул с точностью до ~ 100 нм от плазматической мембраны. В мультфильме ячейки это показано в виде зеленых "возбужденным" мембранных рецепторов, тогда как в клетке или на верхней поверхности клетки не возбуждаются. Полный отчет о микроскопии TIRF была предоставлена Steyer и Алмерс 4.
Рисунок 2. Изображения 100 нм люминесцентные бусины, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. показывает EPI изображения поля зрения с несколькими десятками 100 нм флуоресцентные бусы. Красная точка стрелки бусы, которые поселились на стекло покровное, тогда как синие стрелки указывают на бусы, которые диффундируют в воде. Б. Шоу TIRF изображение одного и того же поля зрения, как показано на А. С этой точки зрения только приверженец бисером показаны красными стрелками видны. Это потому, что эти поселились на стекло coverlsip и, таким образом в течение ~ 100 нм затухающего поля. Бисер показано в по синим стрелкам, не в этом регионе и, таким образом, невидимые на изображениях TIRF. Ниже графики показывают 3D-рендеринга образов. Очевидно, что значительное увеличение отношения сигнал-шум происходит для бисера в затухающего поля при наблюдении с помощью микроскопии TIRF. На самом деле за этими изображениями сигнал-шум для РПИ составила 7,1 ± 0,6, тогда как для TIRF было 20 ± 0,7.
Рисунок 3. Изображения астроциты загружены Fluo-4 кальция индикатор красителя, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. EPI изображения поля зрения с пятью астроцитов. Б. изображение TIRF одного и того же поля зрения показано на В. Отметим, что образы в А и В существенно различаются. Это потому что с TIRF освещения только плазматической мембраны регионах в тесном прикладывание к покровное стекло в образ будут включены. Нижней панели показывают АТФ-вызвали внутриклеточного кальция переходных полученную с РПИ и TIRF микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов 11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклеточного кальция высоты может вызвать высвобождение сигнальных молекул, которые активируют рецепторы нейронов на 11, 12. Это спорный, потому что было доказательств за и против этой точки зрения, как это подчеркивается в обзорах Хейдон 7, 13 и Маккарти 11 лабораторий. Исходя из наших последних изображений срез мозга и электрофизиологических данных, мы утверждали, что лучше и точное понимание динамики астроцитов кальция необходимо прежде, чем новые на базе гипотезы эксперименты могут быть разработаны для определения того, как нейроны, астроциты воздействия 14. В этом видео статье мы представляем простой способ изображения вблизи плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно в культуре астроцитов. Неизбежные технические требования микроскопии TIRF в том, что культивируемые клетки должны быть использованы, поскольку они придерживаются стекло покровное в затухающих глубины поля 3. Стоит отметить, что астроциты в культуре изменить свои профили экспрессии генов по сравнению с теми в естественных условиях 15, и поэтому этот нюанс следует учитывать при реализации этого метода. При этом рассмотрение в виду, однако простой метод мы доклад не позволяют изображения и количественно около плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее применение подхода к астроциты обещает предоставление точных данных о внутриклеточные изменения кальция вблизи плазменной оболочки астроцитов. Наличие таких количественных данных будет полезна для полного понимания астроцитов биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Уэхара Мемориальный фонд Японии (Е. С.), а также Уайтхолл Фонд Национального института неврологических расстройств и инсульта и Штайн-Оппенгеймера фонда премии (для БСК).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 | Tool | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Reagent | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid | Reagent | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red | Reagent | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penicillin-Streptomycin liquid | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodium pyruvate solution | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES solution 1 M | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17502-048 | |
| Horse Serum, Heat-Inactivated | Reagent | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reagent | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red | Reagent | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | Reagent | Invitrogen | 25030-149 | |
| Cell Strainers | Tool | BD Biosciences | 352350 | |
| BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile | Tool | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reagent | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES free acid | Reagent | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | F-14217 | |
| Pluronic® F-127 20% solution in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Immersion Oil TYPE DF | Microscope | Cargill Labs | 16242 | |
| Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume | Tool | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater | Tool | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids | Reagent | Invitrogen | F8803 |
References
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
