初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング
Summary
オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。
Abstract
観測とダイナミックな細胞プロセスを特徴付けることは、静止画像から得られることができない細胞の活動に関する重要な情報を得ることができる。バイタル蛍光プローブ、特に緑色蛍光タンパク質（GFP）は、特定の細胞内区画と細胞構造を標識するために能力に起因する細胞生物学に革命をもたらしています。例えば、GFP（とそのスペクトル変異体）キメラのライブイメージングは、生物や細胞の種類[1-3]の多数の細胞骨格、オルガネラ輸送、および細胞膜のダイナミクスの動的解析のために許可されている。ライブイメージングが普及しているが、このアプローチは、まだ特に初代培養神経細胞で、多くの技術的課題があります。 1つの課題は、有糸分裂後のニューロンでGFP -タグ融合タンパク質の発現であり、他には、光毒性を最小限に退色し、一般的な細胞の健康を維持しながら蛍光画像をキャプチャする機能です。ここでは、比較的低いトランスフェクション率（〜0.5％）が得られる脂質ベースのトランスフェクション法を説明するプロトコルを提供する、しかし完全に偏光ニューロンの撮影に最適です。低トランスフェクション率は、単一の軸索と樹状突起が順行性V.逆行輸送、すなわち、の方向性を確認するために細胞体にその方向へと特徴付けることができるようにすることが不可欠です。イメージングGFPを発現する神経細胞への我々のアプローチは、標準的な広視野蛍光をCCDカメラを装備した顕微鏡、画像キャプチャソフトウェア、および加熱されたイメージングチャンバーに依存しています。我々は特別な光学系や蛍光灯の光源以外の励起要件なしで、例えば、高密度コア小胞、ミトコンドリア、成長円錐、およびアクチンを細胞小器官や構造体のさまざまな画像化している。さらに、スペクトル的に異なる、蛍光標識タンパク質、例えば、GFPとDsRed -タグ付きタンパク質は、共同輸送や他のコーディネート携帯電話のイベントを特徴付けるために、同時に近くに視覚化することができます。ここで説明したイメージング手法は、各種イメージングアプリケーション用の柔軟性があり、顕微鏡が使用可能な場合、比較的少ない費用のための実験室で採用することができます。
Protocol
Discussion
ライブセルイメージングには、培養神経細胞でのオルガネラの輸送の直接観測のための挑戦的な、しかし強力な手法です。困難は、文化の合併症のために貧しい人々のニューロンの健康と手順の上流に起こることができます。したがって、細胞の健康状態は（例については文献4参照）増殖培地で組織培養光顕微鏡を使用中にカバースリップを観察することによってトランスフェクションの前…
Acknowledgements
我々は、この原稿の彼らの注意深い読書のためにハラルドヒュッターとヘレナデッカーに感謝。我々はまた、彼の技術的な専門知識のためにライカマイクロシステムズからREG Sidhuに感謝。この研究は、国立科学及びカナダの技術評議会、賞＃327100から06、及び科学のサイモンフレーザー大学の学部によってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
