Summary
Эта процедура демонстрирует очистки и в лабораторных условиях расширения антиген специфических CD4 + Т-клеток из цельной периферической крови и их визуализации с помощью МНС класс II тетрамеров. Тетрамеров разрешение прямой визуализации Т-клеток с одной специфичности антигенов и определены MHC класса II ограничений.
Abstract
Главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамеров позволяет прямой визуализации антиген специфических CD4 + Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Этот метод основан на весьма специфическое взаимодействие между пептидными загружены МНС и соответствующих рецепторов Т-клеток. Хотя близость одного MHC / пептид молекулы мала, сшивания МНС / пептидные комплексы стрептавидином увеличивает алчность взаимодействия, что позволяет их использовать в качестве окраски реагентов. Из-за относительно низких частотах CD4 + Т-клеток (~ 1 на 300 000 для одного специфичность) данного анализа используются на этапе усиления пробирке увеличить порог обнаружения. Мононуклеаров очищаются из периферической крови от подложки Ficoll. CD4 + клетки затем разделенных негативный отбор с использованием биотинилированного коктейль антител и анти-биотин помечены магнитные шарики. Использование приверженцем клетки CD4-клеток фракция как антиген представляющих клеток, CD4 + Т-клетки разлагаются в средствах массовой информации, добавив пептидных антигенных и ИЛ-2. Расширенный клетки окрашивали соответствующего класса II тетрамер путем инкубации при температуре 37 С в течение часа, а затем окрашивали поверхности антитела, такие как анти-CD4, анти-CD3 и анти-CD25. После маркировки, клетки могут быть непосредственно анализировали с помощью проточной цитометрии. Тетрамер положительных клеток обычно составляют отдельную населения среди расширен CD4 + клеток. Тетрамер положительных клеток, как правило, CD25 + и CD4 часто высока. Потому что уровень фонового окрашивания тетрамер может меняться, положительные результаты окрашивания всегда должно быть по сравнению с окрашиванием же клетки не имеет значения тетрамер. Несколько вариаций этого основного анализа возможны. Тетрамер положительных клеток может быть отсортирован для дальнейшего фенотипического анализа, включения в ELISPOT или распространение анализов или других вторичных анализов. Несколько групп также продемонстрировали совместное окрашивания использованием тетрамеров и либо анти-цитокинов или анти-FOXP3 антител.
Protocol
1. Периферической крови мононуклеарных клеток (PBMC) изоляции
- Получить кровь - кровь должна быть собрана в шприцах или крови труб и анти-коагулируют с гепарином (1:50 соотношение), чтобы предотвратить свертывание крови. Ожидайте выходом около 1 × 10 6 РВМС на мл крови - около 40% из которых будут CD4 положительных (CD4 +) Т-клеток.
- Алиготе крови в 50 мл конические пробирки, 25 мл на трубе. Если кровь отделился, осторожно перемешать до aliquoting распространять плазмы
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 40 мл и легла в основу при составлении 11 мл Ficoll, вставляя в кровь трубки и осторожно удалить пипеткой помощь из пипетки. Ficoll будет медленно стекать в нижней части трубы. Как только уровень выравнивается, медленно удалять пипеткой из крови трубки и выбросьте.
- Cap крови труб и переехать в Aerosolve канистры. Плотно закройте канистры и центрифуге при 900 × г в течение 20 минут - никаких тормозов. Очень важно, чтобы не тормоз в конце этого спина, как тормозная сила не помешает слой клеток.
- После спина, МНПК должны формировать различные белый слой между желтой плазмы (см. выше) и прозрачной Ficoll (см. ниже). Аккуратно скользить от белого слоя клеток крови с помощью пипетки передачи и перехода на новые трубы. Некоторые плазменные и Ficoll может быть составлен с МНПК, но избежать составления любого из красного слоя клеток. Обычно две трубки крови могут быть объединены в одну ячейку трубки на этот шаг, чтобы увеличить размер гранул.
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 50 мл и центрифуге при 500 × г в течение 15 минут - низкая тормозом в aerosolve канистры.
- Аспирацию жидкости, используя пипетку Пастера, стараясь не нарушить гранул
- Лечить с гемолитической буфер добавлением 5-6 мл в каждую пробирку и осторожно смешивания, чтобы удалить сгустки. Инкубируйте в течение не более 5 минут.
- Добавить PBS, в результате чего общий объем до 50 мл и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут - низкая тормоза. Aerosolve канистры больше не нужны для этих медленнее спинами.
- Промыть два раза: аспирацию жидкости, используя пипетку Пастера, заполнить трубу с PBS и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- До последнего шага вымыть, удалить аликвоту ресуспендировали клетки, разведите трипанового синий, и считать использование гемоцитометра. Этот подсчет клеток будут диктовать объемы реагента используется в стадии разделения Т-клеток.
2. CD4 + Т-клеток отделение *
- Аспирацию жидкости и добавляют работы буфера довести общий объем до 40 мкл на 10 миллионов клеток. Обычно для этого требуется 30 мкл буфера плюс остаточный объем гранул.
- Передача этого объема до 15 мл коническую трубку.
- Добавить антител коктейль из комплекта изоляции CD4 - 10 мкл на 10 миллионов клеток, крышка трубки, и место на льду в течение 10 минут
- Удалите трубку изо льда, снимать крышку и добавить 30 мкл работает буфер на 10 миллионов клеток
- Добавить магнитных гранул из комплекта изоляции CD4 - 20 мкл на 10 миллионов клеток, крышка трубки, и место на льду в течение 15 минут
- Добавить десять томов работает буфер для стирки и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Во время спина, созданная магнитом и 5 мл полипропиленовые трубки на вашем рабочем месте
- Аспирацию жидкости из клеточный осадок, добавляют 2 мл работает буфер и удалить сгустки использованием передачи пипетки
- Используя ту же пипетку передачи, передачи клеток в 5 мл трубку и инкубировать в магнит в течение 15 минут
- Тщательно слейте CD4 + клеток долю в отмеченную 15 мл трубки путем обращения магнита и опорожнения все, кроме последней капли
- Добавить еще 2 мл работает буфер для 5 мл трубку и снимите с магнитом
- Осторожно промыть CD4-клетки по бокам от трубы и передачи отмечен 15 мл трубки
- Добавьте 2 мл Т-клеток среду в каждую пробирку, удалить аликвот для подсчета клеток и центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Развести ячейки аликвоты с трипанового синего и считать использование гемоцитометра. Эти клеток будет диктовать, количество скважин для шага культуры расширения.
* Кроме того, MACS колонны и шарики (Miltenyi Biotec), сепаратор AutoMACS клетки (Miltenyi Biotec), или Robosep сепаратор клеток (Технологии стволовых клеток) могут быть использованы в соответствии с инструкциями производит на месте шаги 2.2 - 2.11.
3. В культуре расширения пробирке
- Аспирацию жидкости из CD4 + и CD4-клеток гранулы, и на основе клеток, добавлять питательные среды (обычно 3 млн CD4 + клеток на мл и 10 миллионов CD4-клеток на мл хорошо подходит для создания культуры). Расширение культуры требует 3-5 млн. CD4-клеток на лунку и 2-3 миллионов CD4 + клеток на лунку в общем объеме 1 мл культуральной среды в 48-луночного планшета культуры. Как правило, CD4 + клетки являются предельными населения
- При желании, облучать CD4-клеток (5000 Rad с). Алиготе CD4-клеток в соответствующее число скважин на 48 лунками, добавив 300-500 мкл каждого из них. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа. Приверженцем CD4-клеток будет служить антиген представляющих клеток в расширении культуры.
- Удалите пластину из инкубатора.
- Вымойте скважин путем добавления 500 мкл свежей среды и мягко пипетирования вверх и вниз 12-20 раз, используя передачу пипетки и удаляя все жидкости. Это мытье оставит слой приверженцем антиген представляющих клеток.
- При мытье завершено, добавить ровно столько средств массовой информации к влажной нижней части каждой скважины (примерно 100 мкл) - в противном случае прилипшие клетки высохнет
- Добавить 2-3 млн. клеток CD4 + в каждую лунку. При необходимости добавить дополнительные средства массовой информации довести общий объем в каждой лунке до 1 мл.
- Добавить желаемого пептида в каждую лунку. Типичные концентрации для стимуляции составляет 10 мкг / мл окончательным.
- Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 7 дней.
- Через 7 дней, добавить 50 мкл Hemogen Ил-2 (или эквивалент, например рекомбинантный IL-2, 10 МЕ / мл) в каждую лунку.
- На каждый последующий день, контролировать рост клеток с помощью микроскопа. Поток скважин, которые еще не сливающийся, удаляя половину средств массовой информации, добавляя свежие средства массовой информации и 50 мкл ИЛ-2. Сплит сливной скважин ресуспендирования клеток, движущихся половине клетки пустыми хорошо, добавляя свежие средства массовой информации и 50 мкл ИЛ-2. Вернуться клетки в инкубатор.
- Расширение клетки будут готовы к тетрамер после 13-15 дней культуры.
4. Визуализация Т-клеток путем окрашивания тетрамер
- Покупка или собираться тетрамеров, чтобы соответствовать пептида / МНС комбинации, которые соответствуют стимулировали CD4 + Т-клеток (см. обсуждение на источники тетрамер реагентов). Тетрамеров должна быть ~ 0,5 мг / мл раствора.
- Удалить пластины из инкубатора
- Аккуратно оттянуть половину средств массовой информации из каждой лунки
- Передача аликвоту клеток из каждой лунки - как правило, 75 мкл, или около 50 тысяч клеток - в 5 мл трубки полистирола FACS
- Добавить тетрамер - как правило, 1 мкл на 50 мкл общий объем - и место в 37 ° С инкубатор на 1-2 часа. Кроме того, целесообразно, чтобы окрасить второй аликвоту клеток из каждой лунки с несоответствующие тетрамер в качестве отрицательного контроля.
- Этикетка клетки с анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD25 антитела, добавив 3-10 мкл каждого антител. Дополнительные или альтернативные маркеров антитела могут быть использованы. Однако, не используйте PE меченых антител, так как это канал должен быть зарезервирован для тетрамеров. В это время, а также этикетки одного управления цветом или изотипа использованием дополнительных элементов.
- Инкубируйте антител меченых клеток в течение 15-30 минут на льду или при температуре 4 ° C.
- Промыть каждую пробирку с 0,5 до 2 мл буфера и работает центрифуге при 230 × г в течение 10 минут.
- Тщательно слейте жидкость из трубы СУИМ. Храните все трубы в закрытой емкости (желательно на лед) для последующего анализа FACS.
5. Поток Приобретение Цитометр и анализа
- Калибровка потока Цитометр с использованием эталонных бисером.
- Проверьте настройки прибора:
- Использование неокрашенные клетки управления или изотипа контроля, откорректировать местоположение жизнеспособной ворота лимфоцитов (ФСБ против SSC). Удалить авто-флуоресценции всех каналов на центрирования населения (путем изменения коэффициента усиления настройки) ниже первого десятилетия на каждой оси.
- Использование одного цвета контроля труб, в центре событий в правильном квадранта для каждого отдельного цвета (путем изменения компенсацию настроек).
- У тонкой настройки параметров с помощью инструмента трубки окрашиваются не имеет значения тетрамер. В специальные установки для PE канал может нуждаться в корректировке, поскольку тетрамеров часто пятна ярче, чем антитела контроль. Не имеет значения тетрамер должны пятно <0,5% CD4 + клеток.
- Сбор данных для каждой трубки
- Сбор событий для каждой трубки образца и отрицательные трубки контроля
- Приобретение и спасти по крайней мере 20 тысяч мероприятий для Analysys
- Анализ данных
- Импорт данных файлов в FACS анализ программного обеспечения (например CellQuest программного обеспечения, WinMDI или FlowJo). Начните анализ с использованием трубки окрашивали не имеет значения тетрамер.
- Участок ФСБ против SSC и сделать ворота вокруг живых лимфоцитов (рис. 1, верхняя левая панель).
- Участок CD4 против CD3 (закрытый показать жить только лимфоциты) и нарисуйте вокруг ворот CD3 + и CD4 + популяции (рис. 1 верхняя правая панель).
- Участок CD4 против тетрамер (закрытый показать CD3 + лимфоцитов только) и установить квадрант границы так, что CD4 + + тетрамер населения составляет менее 0,5% (рис. 1 нижняя левая панель).
- Участок CD25 против тетрамер (закрытый показать CD4 + лимфоцитов только) и установить квадрант границы так, что CD25 + + тетрамер населения составляет менее 0,5% (рис. 1 нижняя правая панель).
- Анализ всех пробирок с образцами без изменения ворота.
1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "ALT =" Рисунок 1 "ширина =" 600 "высота =" 342 "/>
Рисунок 1. Представителю отрицательные результаты тетрамер контроль окрашивания. Верхняя левая панель показывает вперед разброс стихи разброс стороны и лимфоцитов ворота размера (R1). Верхнем правом углу панели закрытого для R1 и показывает, муравей-CD4 по сравнению с анти-CD3 и CD3 + (R2) и CD4 + (R3) ворота. Нижней левой панели закрытого для R2 и показывает анти-CD4 по сравнению с тетрамер. Нижней правой панели закрытого для R3 и показывает, анти-CD25 против тетрамер. Квадранта для обоих участков тетрамер были настроены на 0,5%.
6. Представитель Результаты
- Тетрамер позитивные клетки должны быть различны населения среди расширен CD4 + клеток (рис. 2).
- Тетрамер положительных клеток, как правило, CD25 + и CD4 часто высока.
- В некоторых случаях, MHC / пептид сочетание может дать фоне окрашивание (часто вызванные пептид с плохой растворимостью). Такое окрашивание фона можно отличить от истинного положительным моментом, поскольку "ложное срабатывание" клетки не одно отличие населения по обе CD4 против тетрамера или CD25 против тетрамер участков (рис. 3).
Рисунок 2. Представителю положительный результат окрашивания тетрамер. Расположение панели и литниковой стратегии идентичны рисунке 1. Тетрамер позитивные клетки появляются в качестве отдельной CD4 высокой населения на анти-CD4 по сравнению с тетрамер панели и различные CD25 + популяции на анти-CD25 против тетрамер панели.
Рисунок 3. Представитель "ложноположительные" результаты тетрамер окрашивания. Расположение панели и литниковой стратегии идентичны рисунке 1. Анти-CD4 по сравнению с панелью тетрамера показывает нечеткие "насыпью" окрашивания. Анти-CD25 против тетрамера показывает также, "насыпью" окрашивания, без четкой тенденции к будучи CD25 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Понимание роли CD4 + Т-клеток в иммунитете является принципиально важным. Тем не менее, антиген специфических CD4 + Т-клеток может быть трудно обнаружить и изолировать с помощью традиционных методов. В отличие от MHC класса II тетрамеров позволяет прямой визуализации CD4 + Т-клеток с нужными антигенной специфичности. Это видео демонстрирует изоляции, очистка, и в лабораторных условиях усиления CD4 + Т-клеток и их последующей визуализации с помощью тетрамеров. Класс II тетрамеров являются флуоресцентный белок конъюгаты, состоящие из растворимых биотинилированного класса II α / β димеров сопряженных вокруг флуоресцентные меченый стрептавидин ядра (рис. 4). Тетрамеров, используемые в этом видео было произведено лабораторией Teramer основных на Бенароя научно-исследовательский институт использованием культур клеток насекомых (1). Эти тетрамеров готовы, как 0,5 мг / мл раствора и может храниться при температуре 4 ° С в течение 6-18 месяцев. Тетрамеров никогда не должны быть заморожены, а морозостойкость напряжения могут полосу этикетки PE от ядра steptavidin. Класс реактивов II окрашивания можно получить из нескольких источников (табл. 1) и обозначаются как тетрамеров ", ultimers", и мультимеров. Следует отметить, что процедура тетрамер анализа, описанного здесь отличается от процедур, используемых для класса Я тетрамеров. Класс I тетрамер окрашивание, как правило, оптимальным при 4 ° С, в то время как класс II тетрамер окрашивания обычно требует 37 ° C. Класс I тетрамеров более связанно, на Т-клетки, чем класс тетрамеров II из-за сильного кооперативный эффект от CD8 по сравнению с CD4. Анализ тетрамер описанные здесь эффективен при визуализации Т-клеток, специфичных для любой иностранной или самостоятельно антигены, но сила взаимодействия изначально ниже для самостоятельного антигенов. Несколько вариантов анализа возможны. Например, CD4 + Т-клеток может быть дополнительно фракционированного до стимуляции (например, в память и наивно населения), стимулировали использование общего белка или пептида бассейнов (2), или различные процедуры могут быть добавлены в разных скважин для оценки их влияния на антиген конкретный ответ. Поскольку только часть каждую лунку необходимо для анализа тетрамер, оставшиеся клетки окрашивали тетрамера для сортировки или зарезервированы для других целей. Установки для каждого отдельного эксперимента будут диктуется как характеристик образца и научный вопрос задают. Для целей проектирования очень важно знать, HLA тип донорской крови, потому что это будет влиять на эпитопы использоваться для расширения и будет диктовать соответствующие тетрамер, которые должны быть использованы. Знание статус заболевания или иммунизации также может иметь решающее значение для интерпретации результатов. Важно тщательно поддерживать клеток в процессе усиления шаг, так как нездоровые клетки могут дать очень плохие результаты. Кроме того, правильная машина установки, стробирование и отрицательные контроли имеют жизненно важное значение для получения высоких результатов поток качества цитометрии.
Рисунок 4. Схема MHC класса II тетрамер. Красное ядро представляет стрептавидином-PE молекулы. Зеленый и черный расширения представляют MHC класса II α / β димеров. Комплекс присоединился высокий взаимодействия сходство между биотином и стрептавидином.
Таблица 1: Различные источники реагентов класса II окрашивание
| Источник тетрамер | Тип продукта | Веб-адрес |
| Beckman Coulter | Тетрамеров | www.beckman.com |
| NIH тетрамер фонда | Тетрамеров | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Бенароя научно-исследовательский институт | Мультимеров | www.benaroyaresearch.org |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Дика Фоли и Ли Кимбалл для их ключевых ролей в кино-и видеопродукции.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
