Visualiseren van antigeen specifieke CD4 + T-cellen met behulp van MHC klasse II tetrameren

Summary

Deze procedure toont de zuivering en in vitro expansie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen uit heel het perifere bloed en de visualisatie met behulp van MHC klasse II tetrameren. Tetrameren toestaan ​​dat de directe visualisatie van T-cellen met een enkel antigen specificiteit en gedefinieerd MHC klasse II beperking.

Abstract

Grote histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van antigeen specifieke CD4 + T-cellen door flowcytometrie. Deze methode is gebaseerd op de zeer specifieke interactie tussen peptide geladen MHC en de bijbehorende T-cel-receptor. Terwijl de affiniteit van een MHC / peptide molecuul is laag, cross-linking MHC / peptide complexen met streptavidine verhoogt de aviditeit van de interactie, waardoor het gebruik ervan als kleurstoffen. Vanwege de relatief lage frequenties van de CD4 + T-cellen (~ 1 op 300.000 voor een enkele specificiteit) deze test maakt gebruik van een in vitro amplificatie stap te verhogen de drempel van de detectie. Mononucleaire cellen worden gezuiverd uit perifeer bloed door Ficoll onderlaag. CD4 + cellen worden dan van elkaar gescheiden door negatieve selectie met behulp van gebiotinyleerd antilichaam cocktail en anti-biotine gelabeld magnetische korrels. Met behulp van hechtende cellen van de CD4-cel-fractie als antigeen presenterende cellen, CD4 + T-cellen zijn uitgebreid in de media door het toevoegen van een antigene peptiden-en IL-2. De uitgebreide cellen zijn gekleurd met de bijbehorende klasse II tetrameer door incubatie bij 37 C gedurende een uur en daarna gekleurd met oppervlakte-antilichamen zoals anti-CD4, anti-CD3 en anti-CD25. Na de etikettering, kunnen de cellen direct worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie. De tetrameer positieve cellen vormen meestal een aparte bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen. Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog. Omdat het niveau van achtergrond tetrameer vlekken kan variëren, moet positieve kleuring resultaten altijd worden vergeleken met de kleuring van dezelfde cellen met een irrelevante tetrameer. Meerdere variaties van deze fundamentele test zijn mogelijk. Tetrameer positieve cellen kunnen worden gesorteerd voor verdere fenotypische analyse, opname in ELISPOT of proliferatie assays, of andere secundaire testen. Verschillende groepen hebben ook aangetoond dat co-kleuring met behulp van tetrameren en ofwel anti-cytokine of anti-Foxp3 antilichamen.

Protocol

1. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isolatie

1. Verkrijgen van een bloedmonster - bloed moet worden verzameld in spuiten of bloed buizen en anti-gecoaguleerd met heparine (01:50 ratio) om te voorkomen dat stolling. Verwacht een opbrengst van ongeveer 1 × 10 ⁶ PBMC per ml bloed - ongeveer 40% van die zal worden CD4 positieve (CD4 +) T-cellen.
2. Aliquot het bloed in 50 ml conische buizen, 25 ml per buis. Als het bloed is gescheiden, meng voordat aliquoting om het plasma te verdelen
3. Voeg PBS, waardoor het totale volume tot 40 ml en onderlaag door het opstellen van 11 ml Ficoll, het invoegen in bloed tube, en zorgvuldig verwijderen van de pipet Hulp van de pipet. De Ficoll zal langzaam af in de bodem van de buis. Zodra het niveau heeft vereffend is, verwijder dan eerst langzaam de pipet uit het bloed buis en gooi deze weg.
4. Cap het bloed buizen en te verplaatsen naar de Aerosolve canisters. Sluit het canisters en centrifugeer op 900 xg gedurende 20 minuten - geen rem. Het is cruciaal dat er geen rem wordt toegepast aan het einde van deze spin als de remkracht zal de laag van cellen verstoren.
5. Na de spin, moet de PBMC's vormen een duidelijke witte laag tussen de gele plasma (boven) en transparante Ficoll (onder). Voorzichtig afgeroomd witte bloedcellen laag met behulp van een pipet overdracht en transfer naar nieuwe buis. Sommige plasma en Ficoll kan worden opgesteld met de PBMC's, maar vermijd het opstellen van een van de rode bloedcellen laag. Gewoonlijk worden twee buisjes bloed kunnen worden gecombineerd in een cel buis bij deze stap om de korrelgrootte te verhogen.
6. Voeg PBS, waardoor het totale volume op 50 ml en centrifugeer bij 500 xg gedurende 15 minuten - lage rem in aerosolve canisters.
7. Aspireren vloeistof met behulp van een Pasteur pipet, zorg ervoor dat u de pellet te verstoren
8. Behandelen met hemolytische buffer door het toevoegen van 5-6 mL aan elke buis en voorzichtig mengen tot klonten te verwijderen. Incubeer voor niet meer dan 5 minuten.
9. Voeg PBS, waardoor het totale volume op 50 ml en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten - lage rem. Aerosolve bussen zijn niet langer nodig zijn voor deze langzamer draaien.
10. Was twee keer: Zuig vloeistof met behulp van een Pasteur pipet, vul buis met PBS en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten.
11. Voorafgaand aan de laatste wasstap, verwijder dan een portie van re-geschorste cellen, verdunnen met trypan blauw, en tellen met behulp van een hemocytometer. Deze cellen zullen bepalend zijn voor de reagens volumes gebruikt in de T-cel scheiding stap.

2. CD4 + T-cel-scheiding ^*

1. Aspireren vloeistof en voeg draaien buffer om het totale volume te brengen tot 40 uL per 10 miljoen cellen. Meestal is dit vereist 30 uL van de buffer plus de resterende pellet volume.
2. Overdragen dit volume tot een 15 ml conische buis.
3. Voeg antilichaam cocktail van de CD4-isolatie kit - 10 uL per 10 miljoen cellen, cap tube, en plaats op ijs gedurende 10 minuten
4. Verwijder de slang van ijs, verwijder dop, en voeg 30 uL van het runnen van buffer per 10 miljoen cellen
5. Voeg magnetische korrels van de CD4-isolatie kit - 20 uL per 10 miljoen cellen, cap tube, en plaats op ijs gedurende 15 minuten
6. Voeg tien volumes lopen buffer te wassen en bij 230 xg gecentrifugeerd gedurende 10 minuten.
7. Tijdens de spin, het opzetten van de magneet en 5 ml polypropyleen buis in uw werkruimte
8. Aspireren vloeistof uit celpellet, voeg 2 ml buffer draaien en verwijder de groepjes met behulp van een transferpipet
9. Met dezelfde overdracht pipet cellen in de 5 mL buis en broeden in de magneet gedurende 15 minuten
10. Voorzichtig decanteren van de CD4 + cellen fractie in een duidelijke 15 ml buis door het omkeren van de magneet en het legen van alle, maar de laatste druppel
11. Voeg nog een 2 mL van de exploitatie van buffer om de 5 mL buis en te verwijderen uit magneet
12. Voorzichtig spoelen van de CD4-cellen uit de zijkanten van de buis en over te dragen aan een duidelijke 15 ml tube
13. Voeg 2 mL T-cel-medium aan elke buis, verwijder porties voor celtelling en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten.
14. Verdunnen cel monsters met trypan blauw en tellen met behulp van een hemocytometer. Deze cellen zal bepalen van het aantal putten wordt gebruikt voor de uitbreiding cultuur stap.

* Als alternatief kan MACS kolommen en kralen (Miltenyi Biotec), de AutoMACS cel afscheider (Miltenyi Biotec), of Robosep cel afscheider (Stem Cell Technologies) worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant in plaats van stappen 2,2 tot 2,11.

3. In vitro Uitbreiding cultuur

1. Aspireren vloeistof uit de CD4 + en CD4-cel-pellets en op basis van de cel telt, voegt cultuur media (meestal 3 miljoen CD4 + cellen per ml en 10 miljoen CD4-cellen per ml werkt goed voor het opzetten van de cultuur). De uitbreiding cultuur vereist 3-5 miljoen CD4-cellen per well en 2-3 miljoen CD4 +-cellen per putje in een totaal volume van 1 ml cultuur media in een 48 goed cultuur plaat. Typisch, CD4 +-cellen zijn de beperkende bevolking
2. Indien gewenst, bestralen van de CD4-cellen (5000 Rad s). Aliquot CD4-cellen in het juiste aantal putten op een 48 wells plaat door het toevoegen van 300 tot 500 pi aan elk. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur. Van het aanhangend CD4-cellen zal dienen als antigeen presenterende cellen in de uitbreiding cultuur.
3. Haal de plaat uit de incubator.
4. Was de putjes door de toevoeging van 500 ul van vers medium en zacht en neer te pipetteren 12-20 keer met een transfer pipet en het verwijderen van alle van de vloeistof. Dit wassen laat achter een laag van het aanklevende antigeen presenterende cellen.
5. Wanneer het wassen is voltooid, voeg net genoeg media om de bodem van elk putje (ongeveer 100 uL) natte - zoniet worden de hechtende cellen zal uitdrogen
6. Voeg 2-3 miljoen CD4 +-cellen aan elke well. Voeg indien nodig extra media om het totale volume in elk putje tot 1 ml te brengen.
7. Voeg de gewenste peptide in elk putje. De typische concentratie voor stimulatie is 10 ug / mL definitief.
8. Laat de plaat in een 37 ° C incubator gedurende 7 dagen.
9. Na 7 dagen, voeg 50 uL van Hemogen IL-2 (of equivalent, zoals recombinant IL-2, 10 IU / ml) aan elk putje.
10. Op elke volgende dag, monitor celgroei met behulp van een microscoop. Feed putten die nog niet samenvloeiend door het verwijderen van de helft van de media, het toevoegen van verse media en 50 uL van IL-2. Split confluerende putten door resuspenderen van de cellen, het verplaatsen de helft van de cellen naar een lege goed, het toevoegen van vers medium en 50 uL van IL-2. Keer terug cellen incubator.
11. De groeiende cellen zullen klaar zijn voor tetrameer na 13-15 Dagen van cultuur.

4. Visualiseren van T-cellen door tetrameer kleuren

1. Aankoop of monteren tetrameren om de peptide / MHC combinaties die de gestimuleerde CD4 + T-cellen (zie bespreking naar bronnen van tetrameer reagentia) te laten matchen. Tetrameren moet ~ 0,5 mg / ml oplossing zijn.
2. Verwijder de plaat uit broedmachine
3. Voorzichtig te trekken uit de helft van de media uit elk putje
4. Overdracht een aliquot van cellen uit elk putje - meestal 75 pl of ongeveer 50.000 cellen - in een 5 mL polystyreen FACS buis
5. Voeg tetrameer - typisch een pl per 50 microliter totaal volume - en plaats het in 37 ° C incubator gedurende 1-2 uur. Het is ook raadzaam om een ​​tweede volume van cellen vlek uit elk putje met een verkeerde tetrameer als een negatieve controle.
6. Label cellen met anti-CD3, anti-CD4, en anti-CD25 antilichamen door het toevoegen van 3-10 pi van elk antilichaam. Aanvullende of alternatieve antilichaam markers kunnen worden gebruikt. Echter geen gebruik maken van PE-gelabelde antilichamen, omdat dit kanaal moet worden gereserveerd voor de tetrameren. Op dit moment, ook label een kleur of een isotype controle met behulp van extra cellen.
7. Incubeer antilichaam gelabelde cellen gedurende 15-30 minuten op ijs of bij 4 ° C.
8. Was elke buis met 0,5 tot 2 ml buffer draaien en centrifugeer op 230 xg gedurende 10 minuten.
9. Zorgvuldig giet vloeistof uit FACS buizen. Bewaar alle buizen in een afgedekte container (bij voorkeur op ijs) voor daaropvolgende FACS-analyse.

5. Flowcytometer verwerving en analyse

1. Kalibreer de flowcytometer met behulp van referentie-kralen.
2. Controleer instrument instellingen:
   1. Met behulp van ongekleurde cellen of isotype controles, past u de locatie van de levensvatbare lymfocyt gate (FSC vs SSC). De auto-fluorescentie van alle kanalen door het centreren van de bevolking (door het veranderen van de winst-instellingen) onder het eerste decennium op elke as.
   2. Met behulp van een kleur-controle-buizen, centrale gebeurtenissen in de juiste kwadranten voor elke afzonderlijke kleur (door het veranderen van de compensatie-instellingen).
   3. Doe een fijnafstelling van het instrument instellingen met een buis gekleurd met een irrelevante tetrameer. In het bijzonder de instellingen voor de PE-kanaal kan het nodig zijn aangepast omdat tetrameren vaak vlek helderder dan het antilichaam te controleren. De irrelevante tetrameer moet vlek <0,5% van de CD4 + cellen.
3. Verkrijgen van gegevens voor elke buis
   1. Verzamel gebeurtenissen voor elk monster buis en negatieve controle buis
   2. Verwerven en op te slaan ten minste 20.000 evenementen voor Analysys
4. Analyseren van gegevens
   1. Gegevens importeren bestanden in FACS-analyse software (bijv. CellQuest software, WinMDI of FlowJo). Start uw analyse met behulp van een buis gekleurd met een irrelevant tetrameer.
   2. Plot FSC vs SSC en trek een hek rondom het live-lymfocyten (figuur 1, links boven paneel).
   3. Plot CD4 vs CD3 (gated om te leven lymfocyten alleen laten zien) en poorten te tekenen rond de CD3 + en CD4 + populaties (figuur 1 rechts boven paneel).
   4. Plot CD4 vs tetrameer (gated zodat alleen CD3 + lymfocyten) en stel het kwadrant grenzen, zodat de CD4 + + tetrameer bevolking is minder dan 0,5% (zie figuur 1 linksonder paneel).
   5. Plot CD25 vs tetrameer (gated aan CD4 +-lymfocyten alleen show) en het kwadrant grenzen te stellen, zodat de CD25 + + tetrameer bevolking is minder dan 0,5% (zie figuur 1 rechtsonder paneel).
   6. Analyseer alle monsterbuizen zonder de poorten.

1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "alt =" Afbeelding 1 "width =" 600 "height =" 342 "/>

Figuur 1. Vertegenwoordiger negatieve controle tetrameer kleuringen. Het bovenste linker paneel toont voorwaartse verstrooiing verzen zijwaartse verstrooiing en de lymfocyten grootte poort (R1). Het bovenste rechter paneel is gated voor R1 en toont anti-CD4 versus anti-CD3 en de CD3 + (R2) en CD4 + (R3) poorten. De linker paneel is gated voor R2 en toont anti-CD4 versus tetrameer. De lagere rechter paneel is gated voor R3 en toont anti-CD25 versus tetrameer. De kwadranten voor beide tetrameer percelen werden ingesteld op 0,5%.

6. Representatieve resultaten

1. De tetrameer positieve cellen moet een duidelijke bevolking onder de uitbreiding van CD4 + cellen (figuur 2).
2. Tetrameer positieve cellen zijn meestal CD25 + en CD4 vaak hoog.
3. In sommige gevallen kan een MHC / peptide combinatie geven achtergrondkleuring (vaak veroorzaakt door een peptide met een slechte oplosbaarheid). Dergelijke achtergrondkleuring kan worden onderscheiden van een echt positief, want de "valse positieve" cellen zijn niet een afzonderlijke populatie op zowel de CD4-versus tetrameer of de CD25 vs tetrameer plots (figuur 3).

Figuur 2. Vertegenwoordiger positieve tetrameer kleuringen. Het paneel lay-out en gating strategie zijn identiek aan figuur 1. De tetrameer positieve cellen worden weergegeven als een aparte CD4 hoge bevolkingsdichtheid op de anti-CD4 versus tetrameer paneel en een duidelijke CD25 + populatie op de anti-CD25 versus tetrameer paneel.

Figuur 3. Vertegenwoordiger van "valse positieve" tetrameer kleuringen. Het paneel lay-out en gating strategie zijn identiek aan figuur 1. De anti-CD4 versus tetrameer paneel toont een onduidelijke 'ingeterpte "vlekken. De anti-CD25 versus tetrameer toont ook een "ingeterpte" kleuring, met geen duidelijke trend in de richting van zijn CD25 +.

Discussion

Begrijpen van de rol van CD4 + T-cellen in de immuniteit is van fundamenteel belang. Echter, antigeen specifieke CD4 + T-cellen zijn moeilijk te detecteren en het gebruik van traditionele methoden te isoleren. In tegenstelling, MHC klasse II tetrameren kan de directe visualisatie van de CD4 + T-cellen met de gewenste antigen specificiteit. Deze video toont de isolatie, zuivering, en in-vitro-amplificatie van CD4 + T-cellen en de daaropvolgende visualisatie met behulp van tetrameren. Klasse II tetrameren zijn fluorescerend eiwit conjugaten dat bestaat uit oplosbare gebiotinyleerde klasse II α / β dimeren geconjugeerd rond een fluorescent gelabelde streptavidine kern (figuur 4). De tetrameren gebruikt in deze video zijn gemaakt door de Teramer Core Laboratory van de Benaroya Research Institute met behulp van insecten celculturen (1). Deze tetrameren zijn bereid als een 0,5 mg / ml oplossing en kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 6-18 maanden. Tetrameren mag nooit worden bevroren, als vries-dooi spanningen kan de PE-label weg strip uit het steptavidin kern. Klasse II-kleurstoffen kunnen worden verkregen uit verschillende bronnen (tabel 1) en worden aangeduid als tetrameren, "ultimers", en multimeren. Opgemerkt moet worden dat de tetrameer assay procedure die hier beschreven wordt onderscheiden van de procedures die worden gebruikt voor klasse I tetrameren. Klasse I tetrameer kleuring is meestal optimaal bij 4 ° C, terwijl de klasse II tetrameer vlekken over het algemeen 37 ° C vereist Klasse I tetrameren binden meer vast aan T-cellen dan van klasse II tetrameren als gevolg van de sterkere coöperatie effect van CD8 ten opzichte van CD4. De tetrameer test hier beschreven is effectief in het visualiseren van T-cel die specifiek zijn voor het buitenlands of self-antigenen, maar de kracht van interactie is inherent lager voor zelf-antigenen. Verschillende varianten van de test zijn mogelijk. Zo kan bijvoorbeeld CD4 + T-cellen worden verder gefractioneerd voorafgaand aan de stimulatie (bijv. in het geheugen en naïef populaties), gestimuleerd met behulp van een hele eiwit of peptide zwembaden (2), of de verschillende behandelingen kunnen worden toegevoegd aan verschillende putten om hun invloed te meten op het antigeen specifieke reactie. Omdat slechts een deel van elk goed is nodig voor tetrameer analyse, kunnen de resterende cellen gekleurd met tetrameer voor het sorteren of gereserveerd voor andere doeleinden. De setup voor elk individueel experiment zal worden bepaald door zowel de kenmerken van de steekproef en door de wetenschappelijke vraag wordt gesteld. Voor het ontwerp doeleinden is het cruciaal voor de HLA-type van de bloeddonor weten omdat dit zal invloed hebben op de epitopen worden gebruikt voor uitbreiding en zal de bijbehorende tetrameer dat moet worden gebruikt dicteren. Kennis van de ziekte of vaccinatie-status kan ook van cruciaal belang voor de interpretatie van resultaten. Het is belangrijk om zorgvuldig de cellen te behouden tijdens de amplificatiestap, omdat ongezonde cellen kunnen geven zeer slechte resultaten. Ook de juiste machine setup, poorten en negatieve controles zijn van vitaal belang voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit flow cytometrie resultaten.

Figuur 4. Schematische voorstelling van MHC klasse II tetrameer. De rode kern vertegenwoordigt de streptavidine-PE-molecuul. De groene en zwarte extensions vertegenwoordigen de MHC klasse II α / β-dimeren. Het complex wordt vergezeld door de hoge affiniteit interactie tussen biotine en streptavidine.

Tabel 1: Verschillende bronnen van klasse II kleurstoffen

Tetrameer Bron	Producttype	Webadres
Beckman Coulter	Tetrameren	www.beckman.com
NIH tetrameer Facility	Tetrameren	www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core
Proimmune	Ultimers	www.proimmune.com
Benaroya Research Institute	Multimeren	www.benaroyaresearch.org

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR international	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	Hyclone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond Scientific	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman Coulter Inc.	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR international	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR international	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR international	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalge Nunc international	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon BD	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD Biosciences	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent