Görselleştirme Antijen spesifik CD4 + T hücreleri MHC Sınıf II Tetramers kullanarak

Summary

Bu prosedür, arıtma gösteriyor ve in vitro antijen spesifik CD4 + T hücreleri, tüm periferik kan ve MHC sınıf II tetramers kullanarak görselleştirme genişleme. Tetramers tek bir antijen özgüllüğü ve tanımlanan MHC sınıf II kısıtlama ile T hücrelerinin doğrudan görselleştirme izin verir.

Abstract

Major histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II tetramers antijen spesifik CD4 + T hücrelerinin flow sitometri tarafından doğrudan görselleştirme izin verir. Bu yöntem son derece özel bir peptit yüklü MHC ve ilgili T-hücre reseptör arasındaki etkileşimi dayanıyor. MHC / peptid tek bir molekülün yakınlığı düşük olmasına rağmen, çapraz bağlama streptavidin ile MHC / peptid kompleksleri reaktifler boyama olarak kullanımını sağlamak, avidite etkileşimi artırır. CD4 + T hücreleri (~ 1 tek bir özgüllüğü 300.000) nispeten düşük frekanslarda bu testte in vitro amplifikasyon adımda bir algılama eşiğini artırmak için kullanır. Ficoll altında yatan periferik kan mononükleer hücreler temizlenir. CD4 + hücreler, daha sonra biotinlenmiş antikor kokteyli ve anti-biotin etiketli manyetik boncuklar kullanarak negatif seçimi ile ayrılır. CD4 hücre fraksiyonu yapışık hücrelere antijen hücreleri, CD4 + T hücrelerinin antijenik peptid ve IL-2 ekleyerek medya genişletilmiş biçimde sergileyen bir belge olarak kullanılması. Genişletilmiş hücreleri, bir saat 37 C'de inkübe ve daha sonra lekeli, anti-CD4, anti-CD3 ve anti-CD25 gibi yüzey antikorları kullanarak ilgili sınıf II tetramer ile boyandı. Etiketleme sonra, hücreler flow sitometri ile analiz edilebilir. Tetramer pozitif hücreler genellikle genişletilmiş CD4 + hücreler arasında ayrı bir nüfus oluşturmaktadır. Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek. Arka plan tetramer boyanma seviyesi farklılık gösterebilir, çünkü pozitif boyanma sonuçları her zaman ilgisiz bir tetramer aynı hücrelerin boyanması göre olmalıdır. Bu temel testinin Çoklu değişiklikler olabilir. Tetramer pozitif hücrelerin daha fazla fenotipik analiz, ELISPOT veya çoğalması testleri dahil, ya da diğer ikincil testleri için sıralanır olabilir. Bazı gruplar aynı zamanda co-boyama tetramers ve anti-sitokin veya anti-FoxP3 antikorları kullanarak göstermiştir.

Protocol

1. Periferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu

1. Kan örneği al kan, şırınga ve kan tüpleri toplanan pıhtılaşmasını önlemek için heparin (1:50 oranı) ile anti-pıhtılaşmış olmalıdır. Yaklaşık 1 × ⁶ mL kan başına 10 PBMC bir verim bekleyin - CD4 pozitif (CD4 +) T hücreleri yaklaşık% 40 olacaktır.
2. Içine kısım 50 ml konik tüpler, tüp başına 25 ml kan. Kan ayrılmış varsa, plazma dağıtmak aliquoting önce hafifçe karıştırın
3. Toplam hacmi, 40 ml ve 11 ml Ficoll, çizerek altında yatan getirerek, kan tüpü takmadan ve dikkatle pipet pipetlemeyin Yardım çıkarmadan, PBS ekleyin. Ficoll yavaş tüpün dibine drenaj olacaktır. Seviyesi eşitledi sonra, yavaş yavaş kan tüpü pipet çıkarın ve atın.
4. Kan tüpleri kap ve Aerosolve kutu içine hareket. Herhangi bir fren 900 kutu ve santrifüj × g 20 dakika - sıkıca kapatın. Bu frenleme kuvvetini hücre katmanı zarar verecek herhangi bir fren, bu spin sonunda uygulanır kritik öneme sahiptir.
5. Spin sonra PBMC'ler sarı plazma (üstte) ve şeffaf Ficoll (aşağıda) arasındaki belirgin bir beyaz tabaka oluşturur. Beyaz kan hücre tabakasının bir transfer pipeti ve yeni tüp transfer kullanarak hafifçe sıyırmak. Bazı plazma ve Ficoll PBMC'ler ile hazırlanan, ancak herhangi bir kırmızı hücre tabakasının hazırlanması önlemek olabilir. Genellikle iki kan tüpü pelet boyutunu artırmak için bu aşamada bir hücre tüp içine kombine edilebilir.
6. Aerosolve kutu düşük fren - 500 toplam hacmi 50 ml ve santrifüj getirerek × PBS, g 15 dakika boyunca.
7. Pelet rahatsız etmemek için özen Pasteur pipeti kullanarak sıvı aspire
8. Her tüpe 5-6 ml ekleyerek ve öbekler kaldırmak için yavaşça karıştırarak hemolitik tamponu ile şımartın. En fazla 5 dakika inkübe edin.
9. 10 dakika boyunca toplam hacmi 230 ml ve 50 santrifüj getirerek × PBS, g - düşük fren. Aerosolve bidonlarda bu yavaş spin için artık ihtiyaç vardır.
10. Iki kez yıkayın: aspire sıvı Pasteur pipeti kullanarak, 10 dakika için 230 × g PBS ve santrifüj tüp doldurmak.
11. Son yıkama adım önce, bir kısım tekrar askıya hücrelerinin kaldırmak tripan mavi ile seyreltilmiş ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı T hücre ayırma adımda kullanılan reaktif hacimlerini belirleyecektir.

2. CD4 + T hücre ayrımı ^*

1. Sıvı aspire ve toplam hacmi 10 milyon hücre başına 40 uL getirmek için çalışan tampon eklemek. Genellikle bu tampon uL 30 artı kalan pelet hacmi gerektirir.
2. Bu hacim, 15 ml konik tüp aktarın.
3. 10 dakika boyunca buz üzerinde 10 milyon hücre başına 10 uL, kap tüp, yer ve CD4 izolasyon kiti antikor kokteyli ekle
4. , Buz tüpünü çıkarın, kapağı çıkarın ve 10 milyon hücre başına tampon çalışan 30 uL eklemek
5. CD4 izolasyon kiti manyetik boncuk - 10 milyon hücre başına 20 uL, kap tüp ve 15 dakika boyunca buz üzerinde yer
6. 230 × g 'de 10 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj tampon çalışan on hacimleri ekleyin.
7. Spin sırasında, çalışma alanında mıknatıs ve 5 ml polipropilen tüp kurmak
8. , Hücre pelletini sıvı aspire 2 mL çalışan tampon ve bir transfer pipet kullanarak kümeleri kaldırmak
9. Aynı transferi pipet kullanarak, 15 dakika boyunca mıknatıs 5 ml tüp ve inkübe hücrelerinin transferi
10. Tersine mıknatıs tarafından dikkatlice belirgin bir 15 ml tüpe + CD4 hücre fraksiyonu süzün ve tüm ama son damlasına boşalma
11. 2 ml 5 ml tüp tampon çalışan başka bir ekle ve mıknatıs kaldırmak
12. Yavaşça akmasına ve belirgin bir 15 ml tüp transfer kapalı CD4 hücrelerinin durulama
13. Her tüpe 2 mL T hücre orta ekleyin, 10 dakika boyunca 230 × g hücre sayımı ve santrifüj hacimde çıkarın.
14. Tripan mavisi ile hücre alikotları seyreltilir ve bir hemasitometre kullanarak saymak. Bu hücre sayımı genişleme kültür adım için kullanılan kuyuların sayısını belirleyecektir.

2.11 - * Alternatif olarak, sütun ve boncuk MACS (Miltenyi Biotec), AutoMACS hücre ayırıcı (Miltenyi Biotec), ya da Robosep hücre ayırıcı (Kök Hücre Teknolojileri) adımları 2.2 yerine talimatları üretmektedir göre olabilir.

3. In vitro Genişleme kültüründe

1. Sıvı aspire CD4 + ve CD4 hücre hücre sayımı dayalı pelet, kültür ortamı (genellikle 3 milyon CD4 + mL başına hücreleri ve kültür kurmak için 10 milyon mL başına CD4 hücrelerinin iyi çalışıyor). Genişleme kültürü 3-5 milyon CD4 hücrelerinin ortalama 2-3 milyon CD4 + 48 kuyu kültür plaka 1 ml kültür ortamı toplam hacmi de başına hücre gerektirir. Tipik olarak, CD4 + hücreler sınırlayıcı nüfus
2. İsterseniz, CD4 hücrelerinin (5000 Rad ışın tedavisi s). 48 plaka her biri için 300-500 mcL ekleyerek uygun sayıda kuyu içine kısım CD4 hücreleri. 1 saat süreyle 37 ° C inkübatör tabak koyun. Yapışık CD4 hücrelerinin genişlemesi kültürü, antijen sunan hücreler olarak hizmet verecek.
3. Inkübatör plaka çıkarın.
4. 500 uL taze medya ekleyerek ve yavaşça aşağı yukarı 12-20 kez pipetleme ve bir transfer pipetlemeyin kullanarak ve sıvı kaldırarak kuyu yıkayın. Bu yıkama yapışık antijen sunan hücrelerin bir tabaka geride bırakmak.
5. Yıkama işlemi tamamlandığında, her bir kuyunun altındaki ıslak (yaklaşık 100 uL) yeterli medya eklemek aksi takdirde yapışık hücrelere kurumasına
6. 2-3 milyon CD4 + hücreler, her bir kuyunun ekleyin. Gerekirse, her bir kuyunun 1 ml kadar toplam hacmi getirmek için ek medya ekleyin.
7. Her bir kuyu için istenen peptid ekleyin. Uyarılması için tipik derişim 10 ug / son ml.
8. 7 gün boyunca 37 ° C'lik inkübatöre yerleştirin plakası.
9. 7 gün sonra, 50 uL Hemogen eklemek IL-2 (ya da rekombinant IL-2, 10 IU / ml olarak, eşdeğer) her bir kuyunun.
10. Her bir sonraki gün, bir mikroskop kullanılarak hücre büyümesini izlemek. Taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek, ama medyanın yarısı kaldırarak konfluent değildir kuyu besleyin. , Hücreler resuspending hücrelerin yarısı boş bir kuyu, hareketli taze medya ve IL-2 50 uL ekleyerek konfluent kuyu Böl. Hücreleri inkübatör dönün.
11. Genişleyen hücreleri 13-15 gün sonra kültür tetramer için hazır olacak.

4. Tetramer boyama T hücreleri görselleştirme

1. Satın alma veya uyarılmış CD4 + T hücreleri (tetramer reaktifleri kaynakları için tartışmaya bakınız) maç peptid / MHC kombinasyonları maç tetramers monte. Tetramers ~ 0.5 mg / ml olmalıdır.
2. Inkübatör gelen plaka çıkarın.
3. Her iyi medya yarısı dikkatlice çekişi
4. 5 ml polistiren FACS tüp içine genellikle 75 mcL veya yaklaşık 50.000 hücreleri her iyi hücreleri bir kısım transfer
5. , Genellikle 50 mcL toplam hacim başına mcL 1 - ve 1-2 saat yer 37 ° C inkübatör tetramer ekleyin. Negatif kontrol olarak uyumsuz tetramer her kuyudan hücrelerin ikinci bir kısım leke de tavsiye edilir.
6. Her antikor 3-10 mcL ekleyerek anti-CD3, anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları ile etiketleyin hücreleri. Ek veya alternatif antikor belirteçler kullanılabilir. Bu kanal tetramers için ayrılmalıdır Ancak, PE etiketli antikorlar kullanmayın. Şu anda ekstra hücreleri kullanarak, aynı zamanda etiket tek renk veya izotip kontrolleri.
7. 15-30 dakika buz üzerinde veya 4 inkübe antikor etiketli hücreleri ° C
8. 0,5-2 ml, 230 × g 'de 10 dakika boyunca tampon ve santrifüj çalışan her tüp yıkayın.
9. FACS tüpleri dikkatlice süzün sıvı. , Daha sonraki FACS analiz için bir kapalı konteyner buz üzerinde (tercihen) tüm tüpler saklayın.

5. Flow Sitometri Toplama ve Analizi

1. Flow Sitometri referans boncuklar kullanarak kalibre edin.
2. Cihaz ayarlarını kontrol edin:
   1. Lekesiz kontrol hücreleri veya izotip kontrolleri kullanarak, canlı lenfosit kapısı (FSC vs. SSC) konumunu ayarlamak. Her eksen ilk on altındaki nüfus (kazancı ayarlarını değiştirerek) merkezleme tüm kanallar otomatik floresan çıkarın.
   2. , Tek renk kontrolü tüpleri, tek tek her bir renk için doğru kadran içinde merkezi olayları (tazminat ayarlarını değiştirerek) kullanma.
   3. Ilgisiz bir tetramer ile boyanmış bir tüp kullanarak, cihaz ayarları bir ince ayar yapın. Tetramers genellikle antikor kontrolü daha parlak leke, çünkü özellikle PE kanal ayarları ayarlanması gerekebilir. Ilgisiz tetramer <0.5% CD4 + hücreler leke gerekir.
3. Her tüp için veri elde
   1. Toplamak için olayları her numune tüpü ve negatif kontrol tüpü
   2. Analysys için en az 20.000 etkinlik kazanmak ve tasarruf
4. Verileri analiz
   1. Veri alma dosyaları FACS analiz yazılımı (örneğin CellQuest yazılım, WinMDI veya FlowJo). Ilgisiz bir tetramer kullanarak bir tüp boyanmış kullanarak analiz başlayın.
   2. Arsa FSC vs SSC ve canlı lenfositleri (Şekil 1, sol üst panel) etrafında bir kapı çizin.
   3. CD4 Arsa vs CD3 ve CD3 + ve CD4 çevresinde geçitler çizerek (sadece canlı lenfositleri göstermeye kapılı) + nüfus (Şekil 1 sağ üst panel).
   4. Arsa CD4 vs tetramer (CD3 + lenfositlerin sadece göstermek için kapılı) ve kadran sınırlar koymak ve böylece CD4 + tetramer + nüfusun% 0.5 'den az (Şekil 1 sol alt panel).
   5. Arsa CD25 vs tetramer ve CD25 + tetramer + nüfusun% 0.5 'den az (Şekil 1 sağ alt panel), böylece kadran sınırlar koymak (kapılı, CD4 + lenfositlerin sadece göstermek için).
   6. Tüm kapıları değiştirmeden numune tüpleri analiz edin.

1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "alt =" Şekil 1 "width =" 600 "height =" 342 "/>

Şekil 1 Temsilcisi negatif kontrol tetramer boyama sonuçları. Sol üst panel ileri dağılım ayetleri yan dağılım ve lenfosit boyut kapısı (R1) gösterir. R1 için sağ üst panel kapı ve anti-CD3 ve CD3 + (R2) ve CD4 + (R3) kapıları karşı karınca CD4 gösterir. Alt sol panelinde R2 kapılı ve tetramer karşı anti-CD4 gösterir. Sağ alt R3 için kapı ve anti-CD25 karşı tetramer gösterir. Hem tetramer araziler için kadran,% 0.5 'kuruldu.

6. Temsilcisi Sonuçlar

1. Tetramer pozitif hücreler arasında ayrı bir nüfus genişletilmiş CD4 + hücreler (Şekil 2) olmalıdır.
2. Tetramer pozitif hücreler genellikle CD25 + ve genellikle CD4 yüksek.
3. Bazı durumlarda, bir MHC / peptid kombinasyonu arka plan boyama (genellikle çözünür yoksul bir peptid neden) verebilir. Böyle bir arka plan boyama "yanlış pozitif" hücre tetramer veya CD25 tetramer araziler (Şekil 3) vs vs ya CD4 tek bir farklı nüfus değil, çünkü gerçek bir pozitif ayırt edilebilirler.

Şekil 2 Temsilcisi pozitif tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer pozitif hücrelerin farklı bir anti-CD25 karşı tetramer paneli tetramer paneli ve ayrı bir CD25 + nüfus karşı anti-CD4 CD4 yüksek nüfus olarak görünür.

Şekil 3 Temsilcisi "yanlış pozitif" tetramer boyama sonuçları. Panel düzeni ve yolluk strateji Şekil 1 aynıdır. Tetramer paneli karşısında anti-CD4 belirsiz bir "Gömülü" boyanma gösterir. Anti-CD25 karşı tetramer da CD25 + doğru açık bir eğilim ile "Gömülü" boyama, gösterir.

Discussion

Bağışıklık CD4 + T hücrelerinin rolünü anlamak temelde önemli. Ancak, antijen spesifik CD4 + T hücreleri tespit ve geleneksel yöntemler kullanılarak izole etmek zor olabilir. Buna karşılık, CD4 + T hücreleri MHC sınıf II tetramers istenen antijen özgüllüğü ile doğrudan görselleştirme izin verir. Bu video, izolasyon, saflaştırma ve CD4 + T hücreleri ve sonraki görselleştirme kullanarak tetramers in vitro amplifikasyon göstermektedir. Sınıf II Tetramers çözünür biotinlenmiş sınıf II α / β floresan etiketli streptavidin çekirdek (Şekil 4) etrafında konjuge dimerleri oluşan floresan protein konjugatları. Bu video tetramers böcek hücre kültürleri (1) kullanarak Benaroya Araştırma Enstitüsü Teramer Core Laboratuarı tarafından üretildi. Bu tetramers 0.5 mg / ml olarak hazırlanmış ve 4 ° C'de 6-18 ay saklanabilir. Donma-çözülme gerilmeler steptavidin çekirdek uzak PE etiket şerit olarak Tetramers, dondurulmuş asla. Sınıf II boyama reaktifleri çeşitli kaynaklardan (Tablo 1) elde edilebilir ve tetramers, "ultimers" ve multimerleri olarak belirlenmiş. Burada açıklanan tetramer metodlara Sınıf I tetramers için kullanılan prosedürler farklı olduğunu belirtmek gerekir. Sınıf I tetramer boyama 4 genellikle en iyi sınıf II tetramer boyama genellikle 37 gerektirir ° C, ° C CD4 göre Sınıf I tetramers, CD8 güçlü bir kooperatif etkisi nedeniyle Sınıf II tetramers daha T hücreleri daha sıkı bağlayan. Burada açıklanan tetramer tahlil ya ya da kendini yabancı antijenleri için spesifik T hücre görüntülenmesi etkili, ancak etkileşim gücü kendini antijenler için doğal olarak daha düşüktür. Testinin bazı değişiklikler olabilir. Örneğin, CD4 + T hücrelerinin (belleğe örneğin ve naif nüfus) stimülasyonuna önce daha fraksiyone olarak yapabilirsiniz, bir bütün protein ya da peptid Havuzlar (2) ile uyarılır, ya da çeşitli tedaviler antijen üzerindeki etkilerini ölçmek için farklı kuyu eklendi olması olabilir spesifik yanıtı. Her kuyunun sadece bir kısmını tetramer analiz için gerekli olduğundan, geri kalan hücreler sıralama veya diğer amaçlar için ayrılmış tetramer ile boyandı. Her bir deney için kurulum numunenin özellikleri ve hem de bilimsel bir soru soruluyor tarafından dikte olacaktır. Bu genişleme için kullanılan epitoplar etkileyecektir ve kullanılması gereken ilgili tetramer dikte edecek, çünkü tasarım amaçları için kan donör HLA türünü bilmek önemlidir. Hastalık ya da aşı durumu Bilgi sonuçları yorumlama için çok önemli olabilir. Sağlıksız hücreleri çok kötü sonuçlar verebilir beri dikkatle kuvvetlenme adımı sırasında hücreleri korumak için önemlidir. Ayrıca, uygun makine kurulumu, yolluk ve negatif kontrolleri yüksek kalite flow sitometri sonuçları elde etmek için hayati önem taşımaktadır.

Şekil 4 MHC sınıf II tetramer şematik. Kırmızı çekirdek streptavidin-PE molekülü temsil eder. Yeşil ve siyah uzantıları MHC sınıf II α / β dimerleri temsil eder. Kompleksi, biotin ve streptavidin arasındaki yüksek afinite etkileşimi ile katıldı.

Tablo 1: Çeşitli kaynaklar sınıf II boyama reaktifleri

Tetramer Kaynak	Ürün Tipi	Web Adresi
Beckman Coulter	Tetramers	www.beckman.com
NIH tetramer Tesisleri	Tetramers	www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core
Proimmune	Ultimers	www.proimmune.com
Benaroya Araştırma Enstitüsü	Multimerleri	www.benaroyaresearch.org

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR international	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	Hyclone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond Scientific	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman Coulter Inc.	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR international	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR international	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR international	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalge Nunc international	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon BD	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD Biosciences	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent