Summary
Detta förfarande visar på rening och in vitro utbyggnad av antigen CD4 + T-celler från hela perifert blod och visualisering med hjälp av MHC klass II tetramers. Tetramers tillåter direkt visualisering av T-celler med en enda antigenspecificitet och definieras MHC klass II begränsning.
Abstract
Stora histocompatibility komplex (MHC) klass II tetramers tillåter direkt visualisering av antigen CD4 + T-celler med flödescytometri. Denna metod förlitar sig på den mycket specifika interaktionen mellan peptid laddas MHC och motsvarande T-cells receptorn. Medan affinitet av en enda MHC / peptid molekylen är låg, tvärbindande MHC / peptid komplex med streptavidin ökar aviditet av samverkan, vilket gör att de används som färgning reagenser. På grund av den relativt låga frekvenser av CD4 + T-celler (~ 1 på 300 tusen för en enda specificitet) denna analys använder en in vitro amplifieringssteg att öka sin tröskel för upptäckt. Mononukleära celler renas från perifert blod med Ficoll underlag. CD4 + celler separeras därefter genom negativa val med biotinylerad antikropp cocktail och anti-biotin märkt magnetiska kulor. Använda anhängare celler från CD4-celler delen som antigenpresenterande celler, CD4 + T-celler utvidgas i media genom att lägga till en antigen peptid och IL-2. Den utökade cellerna färgas med motsvarande klass II tetramer genom att inkubera vid 37 ° C i en timme och sedan färgas med yta antikroppar som anti-CD4, anti-CD3 och anti-CD25. Efter märkning kan cellerna direkt analyseras med flödescytometri. Den tetramer positiva celler bildar oftast en distinkt population bland de utökade CD4 + celler. Tetramer positiva celler är oftast CD25 + och ofta CD4 hög. Eftersom nivån av bakgrunden tetramer färgning kan variera, bör positiv färgning resultat alltid jämföras med färgning av samma celler med en irrelevant tetramer. Flera varianter av denna grundläggande analys är möjliga. Tetramer positiva celler kan sorteras för vidare fenotypisk analys, ingå i ELISPOT eller analyser spridning eller andra sekundära analyser. Flera grupper har också visat co-färgning hjälp tetramers och antingen mot cytokin eller anti-FOXP3 antikroppar.
Protocol
1. Perifera mononukleära celler (PBMC) isolering
- Skaffa ett blodprov - Blod ska samlas i sprutor eller rör blod och anti-koagulerat med heparin (1:50 ratio) för att förhindra koagulering. Räkna med en avkastning på ca 1 × 10 6 PBMC per ml blod - cirka 40% av dessa kommer att CD4-positiva (CD4 +) T-celler.
- Alikvotera blodet i 50 ml koniska rör, 25 ml per rör. Om blod har separerat, blanda försiktigt innan alikvotering att distribuera plasma
- Tillsätt PBS, vilket den totala volymen till 40 ml och underlaget genom att utarbeta 11 ml Ficoll, sätter i blod rör, och försiktigt ta bort pipettera Stöd från pipetten. Den Ficoll kommer sakta rinna ner i botten av röret. När nivån har avstannat, sakta ut pipetten ur blodet röret och kasta.
- Cap blodet rören och flytta in i Aerosolve kapslarna. Stäng den kapslarna och centrifugera vid 900 × gi 20 minuter - ingen broms. Det är viktigt att det inte är ansatt i slutet av denna spin eftersom bromskraften stör lager av celler.
- Efter utdelningen bör PBMC bilda en tydlig vitt lager mellan de gula plasma (ovan) och transparent Ficoll (nedan). Försiktigt skumma av vitt lager blodkroppar med hjälp av en pipett och för över till nya rör. Vissa plasma och Ficoll kan dras upp med PBMC, men undvik att dra upp någon av de röda blodkropparnas lagret. Vanligtvis två Blodrör kan kombineras till en cell rör vid detta steg för att öka pelleten storlek.
- Tillsätt PBS, vilket den totala volymen till 50 ml och centrifugera vid 500 × gi 15 minuter - låg bromsen i aerosolve kanistrar.
- Aspirera vätskan med en pasteurpipett och var noga med att inte störa pelleten
- Behandla med hemolytisk buffert genom att tillsätta 5-6 ml till varje rör och försiktigt blanda för att ta bort klumpar. Inkubera i högst 5 minuter.
- Tillsätt PBS, vilket den totala volymen till 50 ml och centrifugera vid 230 × gi 10 minuter - låg broms. Aerosolve kapslarna inte längre behövs för dessa långsammare snurrar.
- Tvätta två gånger: Aspirera vätskan med en pasteurpipett, fyller röret med PBS och centrifugera vid 230 × gi 10 minuter.
- Före den sista tvätten steget, ta bort en alikvot av resuspenderas celler, späd med trypan blå, och räkna med en hemocytometer. Detta celler kommer att diktera reagensen volymer som används i T cellseparation steg.
2. CD4 + T-cell separation *
- Aspirera vätskan och lägg löpande buffert för att få den totala volymen upp till 40 uL per 10 miljoner celler. Vanligtvis kräver 30 ul buffert plus kvarvarande pellets volym.
- Överför denna volym till ett 15 ml koniskt rör.
- Lägg antikropp cocktail från CD4 isolering kit - 10 uL per 10 miljoner celler, mössa rör och placera på is i 10 minuter
- Ta bort röret från isen, ta bort locket och tillsätt 30 ul löpande buffert per 10 miljoner celler
- Lägg till magnetiska kulor från CD4 isolering kit - 20 uL per 10 miljoner celler, mössa rör och placera på is i 15 minuter
- Lägg till tio volymer av löpande buffert för att tvätta och centrifugera vid 230 × gi 10 minuter.
- Under spinn, inrättat magneten och 5 ml polypropylen rör i din arbetsyta
- Aspirera vätska från cellpelleten, tillsätt 2 ml löpande buffert och ta bort klumpar med en överföringspipett
- Med samma överföringen pipett celler i 5 ml rör och inkubera i magnet för 15 minuter
- Försiktigt dekantera CD4 + celler bråkdel till en markant 15 ml rör genom att vända magneten och tömma alla utom den sista droppen
- Lägg till ytterligare 2 ml löpande buffert till 5 ml rör och ta bort från magneten
- Försiktigt skölja CD4-celler från sidorna av röret och överför till en märkt 15 ml rör
- Tillsätt 2 ml T-cell medellång till varje rör, ta bort alikvoter för cell räkning och centrifugera vid 230 × gi 10 minuter.
- Späd cell portioner med trypan blå och räkna med en hemocytometer. Dessa celler kommer att diktera hur många brunnar som används för expansionen kulturen steg.
* Alternativt kan MACS kolumner och pärlor (Miltenyi Biotec), den AutoMACS cellen separator (Miltenyi Biotec) eller Robosep cell sorterare (Stem Cell Technologies) användas enligt tillverkarens anvisningar i stället för steg från 2,2 till 2,11.
3. In vitro Expansion kultur
- Aspirera vätska från CD4 + och CD4-celler pellets och, baserat på blodkroppar, lägg odlingsmedia (vanligtvis 3 miljoner CD4 + celler per ml och 10 miljoner CD4-celler per ml fungerar bra för att inrätta kultur). Utbyggnaden kulturen kräver 3 till 5.000.000 CD4-celler per brunn och 2 till 3.000.000 CD4 + celler per brunn i en total volym av 1 medier ml kultur i en 48 bra kultur plattan. Vanligtvis CD4 + celler är den begränsande befolkningen
- Om du vill kan bestråla CD4-celler (5000 Rad s). Alikvotera CD4-celler i lämpligt antal brunnar på en 48 brunnar genom att lägga 300-500 mikroliter till varje. Placera plattan i ett 37 ° C inkubator i 1 timme. Den tillhörande CD4-celler kommer att fungera som antigenpresenterande celler i expansionen kulturen.
- Avlägsna plattan från kuvösen.
- Tvätta brunnarna genom att lägga till 500 ul av färska medier och försiktigt pipettera upp och ned 12-20 gånger med hjälp av en pipett och ta bort all vätska. Detta tvätta kommer att lämna efter ett lager av anhängare antigenpresenterande celler.
- När tvätten är klar, lägg bara tillräckligt med material för att blöta ner i varje brunn (ca 100 UL) - annars tillhörande cellerna kommer att torka ut
- Tillsätt 2 till 3.000.000 CD4 + celler i varje brunn. Om det behövs, lägga till ytterligare media för att få den totala volymen i varje brunn upp till 1 ml.
- Lägg till önskade peptiden i varje brunn. Den typiska koncentrationen för stimulering är 10 ug / ml final.
- Placera plattan i 37 ° C inkubator i 7 dagar.
- Efter 7 dagar, tillsätt 50 ul Hemogen IL-2 (eller motsvarande, såsom rekombinant IL-2, 10 IU / mL) i varje brunn.
- Vid varje efterföljande dag, övervaka celltillväxt med hjälp av ett mikroskop. Feed brunnar som ännu inte konfluenta genom att ta bort hälften av medier, lägga till nytt material och 50 ul av IL-2. Split sammanflytande brunnarna genom resuspending cellerna, flytta hälften av cellerna till en tom bra, lägga till nytt material och 50 ul av IL-2. Återgå celler till inkubatorn.
- Den expanderande cellerna är redo för tetramer efter 13-15 dagar av kultur.
4. Visualisering T-celler genom tetramer färgning
- Köp eller montera tetramers att matcha peptid / MHC kombinationer som matchar det stimulerade CD4 + T-celler (se diskussion om källor till tetramer reagenser). Tetramers bör vara ~ 0,5 mg / ml lösning.
- Avlägsna plattan från kuvösen
- Försiktigt dra bort hälften av media från varje brunn
- Överföring en delmängd av celler från varje brunn - typiskt 75 mikroliter eller cirka 50.000 celler - i ett 5 mL polystyren FACS tub
- Lägg tetramer - typiskt 1 mikroliter per 50 mikroliter total volym - och placera i 37 ° C inkubator för 1-2 timmar. Det är också lämpligt att färga ett andra delprov av celler från varje brunn med ett omaka tetramer som negativ kontroll.
- Etikett celler med anti-CD3, anti-CD4 och anti-CD25 antikroppar genom att lägga 30-10 mikroliter av varje antikropp. Kompletterande eller alternativa antikroppar markörer kan användas. Men inte använda PE märkta antikroppar, eftersom denna kanal måste reserveras för tetramers. Vid denna tid även etiketten enda färg eller isotyp kontroller med hjälp av extra celler.
- Inkubera antikropp märkt celler i 15-30 minuter på is eller vid 4 ° C.
- Tvätta varje rör med 0,5 till 2 ml löpande buffert och centrifugera vid 230 × gi 10 minuter.
- Försiktigt Häll vätskan ur FACS rör. Förvara alla rör i en täckt behållare (helst på is) för senare FACS analys.
5. Flödescytometer och analys
- Kalibrera flödescytometern med referens pärlor.
- Kontrollera instrumentets inställningar:
- Använda ofärgade celler eller kontroller isotyp, justera placeringen av livskraftiga lymfocyter porten (FSC mot SSC). Ta bort auto-fluorescens från alla kanaler genom att centrera befolkningen (genom att ändra förstärkning inställningar) under det första decenniet på varje axel.
- Använda enda rör färgkontroll, mitt händelser i rätt kvadrant för varje enskild färg (genom att ändra ersättningen inställningar).
- Gör en finjustering av instrumentets inställningar med hjälp av ett rör som färgats med en irrelevant tetramer. Särskilt inställningarna för PE-kanalen kan behöva justeras eftersom tetramers ofta fläcken ljusare än antikropp kontroll. Den irrelevanta tetramer bör fläcken <0,5% av CD4 + celler.
- Skaffa data för varje rör
- Samla händelser för varje provrör och negativ kontroll tub
- Förvärva och sparar minst 20.000 händelser för Analysys
- Analysera data
- Importera datafiler till FACS analys programvara (t ex CellQuest programvara, WinMDI eller FlowJo). Börja din analys med ett rör färgas med en irrelevant tetramer.
- Tomt FSC vs SSC och rita en grind runt bor lymfocyter (Figur 1, överst till vänster).
- Tomt CD4 vs CD3 (gated att direktsända lymfocyter bara) och rita grindar runt CD3 + och CD4 + populationer (figur 1 övre högra panelen).
- Tomt CD4 vs tetramer (gated att visa CD3 +-lymfocyter endast) och ställ in kvadrant gränser så att CD4 + tetramer + befolkning är mindre än 0,5% (figur 1 längst ner till vänster).
- Tomt CD25 vs tetramer (gated att visa CD4 +-lymfocyter endast) och ställ in kvadrant gränser så att CD25 + tetramer + befolkning är mindre än 0,5% (figur 1 längst ner till höger panel).
- Analysera alla provrör utan att ändra portarna.
1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png "alt =" Bild 1 "width =" 600 "height =" 342 "/>
Figur 1. Representant negativ kontroll tetramer färgning resultat. Den övre vänstra panelen visar Forward Scatter verser Side Scatter och lymfocyter storlek porten (R1). Den övre högra panelen är gated för R1 och visar ant-CD4 kontra anti-CD3 och CD3 + (R2) och CD4 + (R3) grindar. Den nedre vänstra panelen är gated för R2 och visar anti-CD4 kontra tetramer. Den nedre högra panelen är gated för R3 och visar anti-CD25 kontra tetramer. Den kvadranter för både tetramer tomter sattes till 0,5%.
6. Representativa resultat
- Den tetramer positiva celler ska vara en distinkt population bland de utökade CD4 + celler (Figur 2).
- Tetramer positiva celler är oftast CD25 + och ofta CD4 hög.
- I vissa fall kan en MHC / peptid kombination ger bakgrundsfärgning (ofta orsakad av en peptid med dålig löslighet). Sådana bakgrundsfärgning kan skiljas från ett sant positivt eftersom "falskt positiva" celler inte en enda distinkt population på antingen CD4 kontra tetramer eller CD25 vs tetramer tomter (Figur 3).
Figur 2. Representant positiva tetramer färgning resultat. Panelen layout och gating strategi är identisk med figur 1. Den tetramer positiva celler visas som en distinkt CD4 stor befolkning på anti-CD4 kontra tetramer panel och en distinkt CD25 + befolkning på anti-CD25 kontra tetramer panel.
Figur 3. Representant "falskt positiva" tetramer färgning resultat. Panelen layout och gating strategi är identisk med figur 1. Den anti-CD4 kontra tetramer panelen visar ett otydligt "mounded" färgning. Den anti-CD25 kontra tetramer visar också en "mounded" färgning, utan någon tydlig trend mot att vara CD25 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att förstå betydelsen av CD4 + T-celler i immunitet är av grundläggande betydelse. Däremot kan antigen CD4 + T-celler vara svårt att upptäcka och isolera med traditionella metoder. Däremot MHC klass II tetramers möjligt att direkt visualisering av CD4 + T-celler med önskad antigenspecificitet. Denna video visar isolering, rening, och in vitro amplifiering av CD4 + T-celler och deras efterföljande visualisering med hjälp tetramers. Klass II Tetramers är fluorescerande protein konjugat som består av lösliga biotinylerad klass II α / β dimerer konjugerad runt en märkt fluorescerande streptavidin kärna (Figur 4). Den tetramers används i den här videon producerades av Teramer Kärna Laboratory vid Benaroya Research Institute med hjälp av insekt cellkulturer (1). Dessa tetramers bereds som en 0,5 mg / ml och kan lagras vid 4 ° C i 6-18 månader. Tetramers får aldrig frysas, eftersom frys-tö betonar kan remsa PE-etiketten från steptavidin kärna. Klass II färgreagenser kan erhållas från flera källor (tabell 1) och betecknas som tetramers "ultimers", och multimers. Det bör noteras att tetramer analysen procedur som beskrivs här skiljer sig från de förfaranden som används för klass I tetramers. Klass I tetramer färgning är oftast optimalt vid 4 ° C, medan klass II tetramer färgning i allmänhet kräver 37 ° C. Klass I tetramers binder hårdare till T-celler än klass II tetramers på grund av den starkare kooperativa effekten av CD8 jämfört med CD4. Den tetramer analys som beskrivs här är effektivt visualisera T-cell specifika för antingen utländska eller själv antigener, men styrkan i samspelet sig är lägre för egen antigener. Flera varianter av analysen är möjliga. Till exempel kan CD4 + T-celler ytterligare fraktioneras före stimulering (t.ex. i minnet och naiva populationer), stimuleras med hjälp av en hel protein eller peptid pooler (2), eller olika behandlingar kan läggas till olika brunnar för att mäta deras inflytande på antigenet specifikt svar. Eftersom endast en del av varje brunn behövs för tetramer analys, kan den återstående cellerna färgas med tetramer för sortering eller reserverats för andra ändamål. Installationsprogrammet för varje experiment kommer att dikteras både av egenskaper hos provet och av den vetenskapliga fråga som ställs. För design skäl är det viktigt att veta HLA typ av blodgivare eftersom detta kommer att påverka de epitoper som används för expansion och kommer att diktera motsvarande tetramer som måste användas. Kunskap om sjukdomen eller vaccinationsstatus kan också vara avgörande för tolkningen av resultaten. Det är viktigt att noga upprätthålla cellernas under amplifieringssteg, eftersom sjuka celler kan ge mycket dåliga resultat. Även riktig maskin setup, gating och negativa kontroller är av avgörande betydelse för att få resultat med hög kvalitet flödescytometri.
Figur 4. Schematisk av MHC klass II tetramer. Den röda kärnan representerar streptavidin-PE-molekylen. Den gröna och svarta förlängningar representera MHC klass II α / β dimers. Komplexet sällskap av hög affinitet samspelet mellan biotin och streptavidin.
Tabell 1: Olika källor av klass II färgreagenser
| Tetramer Källa | Typ av produkt | Webbadress |
| Beckman Coulter | Tetramers | www.beckman.com |
| NIH tetramer Facility | Tetramers | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya Forskningsinstitut | Multimers | www.benaroyaresearch.org |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dick Foley och Leigh Kimball för nyckelroller i filma och videoproduktion.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
