Summary
この手順では、精製および抗原特異的CD4 + MHCクラスIIテトラマーを用いて全末梢血とその可視化から、T細胞のin vitroでの展開の例を示します。四量体は、単一の抗原特異性と定義されているMHCクラスII制限とT細胞の直接可視化を可能にする。
Abstract
主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIIテトラマーは、抗原特異的CD4 +フローサイトメトリーによるT細胞の直接可視化を可能にする。このメソッドは、ペプチドロードされたMHCと対応するT細胞受容体との間の非常に特異的な相互作用に依存しています。単一MHC /ペプチド分子の親和性は低いですが、ストレプトアビジンとMHC /ペプチド複合体を架橋する染色試薬としての利用を可能にする、相互作用の結合力を増加させる。ためにCD4 + T細胞（単特異性30万で〜1）の比較的低い周波数からこのアッセイでは検出のしきい値を高めるためにin vitroでの増幅工程に使用しています。単核細胞をFicollの下敷きにより末梢血から精製されています。 CD4 +細胞は、その後、ビオチン化抗体カクテルとAnti - Biotin標識した磁気ビーズを用いてネガティブセレクションによって分離される。抗原提示細胞、CD4 + T細胞は抗原ペプチドとIL - 2を追加することで、メディアで展開されるようにCD4細胞分画から接着細胞を使用する。拡張された細胞は、抗CD4、抗CD3および抗CD25などの表面の抗体を用いて一時間、その後、ステンドグラス、37℃でインキュベートすることにより、対応するクラスIIテトラマーで染色されています。標識後、細胞を直接フローサイトメトリーによって分析することができます。テトラマー陽性細胞は、通常、拡張されたCD4 +細胞の間で明確な集団を形成する。テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。バックグラウンドのテトラマー染色のレベルが異なる場合があるため、陽性染色の結果は常に無関係の四量体と同じ細胞の染色と比較する必要があります。この基本的なアッセイの複数のバリエーションが可能です。テトラマー陽性細胞は、さらに表現型解析、ELISPOTまたは増殖アッセイに含める、または他の二次アッセイのためにソートすることができる。いくつかのグループはまた、四量体と抗サイトカインや抗Foxp3の抗体のいずれかを使用して共同で染色を実証している。
Protocol
1。末梢血単核細胞（PBMC）分離
- 血液サンプルを入手する - 血液は凝固を防ぐために注射器や血液の管と（1:50比）ヘパリンによる抗凝固に収集する必要があります。約1 ×血液1mL当たり10 6 PBMCの利回りを期待する- CD4陽性（CD4 +）T細胞となる約40％、そのうち。
- 50 mLコニカルチューブ、チューブあたり25 mLに分注し血を。血液が分離されている場合は、軽くプラズマを配布するために小分けする前に混ぜる
- 血管に挿入し、フィコール11 mLを策定し、慎重にピペットからピペットエイドを削除して40 mLのとアンダーレイの総容積をもたらし、PBSを追加。フィコールは徐々にチューブの底部に排出されます。レベルが均等化された後、徐々に血液チューブからピペットを取り外して廃棄します。
- 血液チューブにフタをし、Aerosolveキャニスターに移動します。ブレーキなし - しっかりと900缶と遠心× gで20分間を閉じます。それは、制動力が細胞の層を乱すので、ブレーキがこのスピンの最後に適用されていないことが重要です。
- スピンした後、末梢血単核球は黄色のプラズマ（上記）と透明フィコール（下）の間に明確な白い層を形成すべきである。静かに転送ピペットと新しいチューブへの転送を使用して白血球の層をオフに脱脂。いくつかの血漿とフィコールは、末梢血で策定が、赤血球層のいずれかを策定回避することができます。通常2つの血液の管はペレットのサイズを増やすには、この段階で一つのセルのチューブにまとめることができます。
- 15分間500 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - aerosolveキャニスターの低いブレーキを。
- ペレットを乱さないように注意しながら、パスツールピペットを用いて液体を吸引除去する
- 各チューブに5〜6 mLを加えると軽く塊を除去するために混合することにより、溶血バッファーで扱う。せいぜい5分間インキュベートします。
- 10分間、230 × gで50 mLのと遠心分離する総量をもたらす、PBSを追加 - 低いブレーキを。 Aerosolveキャニスターは、これらの低速回転のために不要になります。
- 2回洗浄：パスツールピペットを用いて吸引液を、10分間230 × gでPBSと遠心機でチューブを埋める。
- 最後の洗浄工程の前に、、再懸濁した細胞のアリコートを削除するトリパンブルーで希釈し、血球計算盤を用いて数える。この細胞数は、T細胞の分離工程で使用される試薬の量が決まります。
2。 CD4 + T細胞の分離*
- 液体を吸引し、10万個の細胞あたり40 ULに全量を持って実行しているバッファを追加します。通常、これは、バッファに加えて残留ペレットの体積の30 ULを必要とします。
- 15 mLコニカルチューブにこのボリュームを転送します。
- CD4分離キットから抗体のカクテルを追加 - 10 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および10分間氷上に置きます
- 、氷からチューブを外しキャップを外し、10万個の細胞あたりのバッファを実行している30 ULを追加する
- CD4のアイソレーションキットから磁気ビーズを追加 - 20 10万個の細胞あたりのUL、キャップのチューブ、および15分間氷上で場所を
- 10分間、230 × gで洗浄し、遠心してバッファを実行しているの10巻を追加。
- スピン中は、ワークスペース内の磁石と5mLのポリプロピレンチューブを設置
- 、細胞ペレットから液を吸引除去する2mLの実行中のバッファを追加し、転送ピペットを使用して塊を取り除く
- 同じ転送ピペットを使用して、15分間磁石で5 mLのチューブとインキュベートに細胞を移す
- 慎重にCD4 +反転磁石によってマーク15mLのチューブに細胞画分をデカントし、すべてが最後の一滴を空に
- 5 mLのチューブにバッファを実行しているの別の2 mlを加え磁石から削除
- 優しくチューブの側面と著しい15 mLの試験管に転送をオフにCD4細胞をリンス
- 各チューブに2 mLのT細胞の培地を追加し、10分間230 × gで細胞計数および遠心のためのアリコートを削除します。
- トリパンブルーで細胞のアリコートを希釈し、血球計算盤を用いて数える。これらの細胞数は、拡大培養のステップのために使用される井戸の数が決まります。
2.11 - *また、MACSカラムとビーズ（Miltenyi Biotec社）、AutoMACS電池セパレータ（Miltenyi Biotec社）、またはRobosep電池セパレータ（幹細胞技術は）ステップ2.2の代わりに指示を製造するにしたがって使用することができます。
3。 in vitroでの拡大培養に
- 細胞数に基づいて、CD4 +およびCD4細胞ペレットから液を吸引し、（通常は300万CD4 + mL当たりの細胞とmLの1千万人ものCD4細胞が培養をセットアップするためにうまく機能する）培地を加える。拡大培養は48穴培養プレートに1mLの培養培地の総体積に1ウェルあたり3〜5000000 CD4細胞と2〜3000000 CD4 +ウェルあたりの細胞が必要です。一般的に、CD4 +細胞は、限定的な集団である
- 必要に応じて、CD4細胞を（5000ラッド照射秒）。それぞれに300〜500μLを添加することにより、48ウェルプレート上のウェルに適切な数に分注しCD4細胞。 1時間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。 CD4細胞接着は、拡大培養で抗原提示細胞として機能します。
- インキュベーターからプレートを取り外します。
- 新鮮な培地の500μLのを追加し、軽く12〜20回上下にピペッティングし、転送ピペットを用いて、液体のすべてを削除して井戸を洗浄してください。この洗浄は、付着性抗原提示細胞の層を残すだろう。
- 洗浄が完了すると、各ウェルの底部（約100 UL）を濡らすのに十分なメディアを追加する - 特に接着細胞が完全に乾くだろう
- 各ウェルに2〜3000000 CD4 +細胞を追加。必要に応じて、1 mLのようにそれぞれの総ボリュームを起動するために追加のメディアを追加します。
- 各ウェルに所望のペプチドを追加。刺激のための典型的な濃度は10 ug / mlと最後のです。
- 7日間、37℃インキュベーターで場所のプレート。
- 7日後、各ウェルにHemogen IL - 2の50のUL（または組換えIL - 2、10 IU / mLのような、相当する）を追加。
- 後続の各日に、顕微鏡を用いて細胞増殖を監視する。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加し、まだメディアの半分を削除することにより、コンフルエントでない井戸を養う。新鮮な培地とIL - 2の50 ULを追加して、空のウェルに細胞の半分を移動、細胞を再懸濁することによりコンフルエントに井戸を分割する。インキュベーターにセルを返します。
- 拡大する細胞は、培養の13から15日後に四量体のための準備が整います。
4。テトラマー染色によりT細胞の可視化
- 購入するまたは刺激されたCD4 + T細胞（テトラマー試薬の源のための議論を参照）と一致するペプチド/ MHCの組み合わせと一致するように四量体を組み立てる。四量体は、〜0.5 mg / mLのソリューションでなければなりません。
- インキュベーターからプレートを取り外します
- 慎重に各ウェルから培地の半分をオフに描く
- 5mLのポリスチレンのFACSチューブに - 通常75μLまたは約50,000細胞 - 各ウェルからの細胞のアリコートを転送する
- 37と場所℃のインキュベーターに1-2時間 - 50μL合計体積当たり、通常、1μL - 四量体を追加。また、ネガティブコントロールとしてのミスマッチ四量体を各ウェルからの細胞の第2のアリコートを染色することをお勧めします。
- 各抗体の30から10μLを加えることによって抗CD3、抗CD4、および抗CD25抗体でラベル細胞。追加のまたは別の抗体マーカーを使用することができます。このチャネルが四量体のために予約されている必要がありますしかし、PE標識抗体を使用しないでください。この時点で、また余分な細胞を使用して、単一の色またはアイソタイプコントロールにラベルを付けます。
- 氷上または4℃で15〜30分間抗体標識された細胞をインキュベート℃に
- 10分間、230 × gで0.5〜2 mLを実行しているバッファと遠心機で各チューブを洗浄する。
- FACSチューブから注意深くデカント液体。その後のFACS解析のための覆われた容器（できれば氷の上）に全てのチューブを保管してください。
5。フローサイトメーターの収集と解析
- 参照のビーズを使用してフローサイトメーターを較正します。
- 楽器の設定を確認します。
- 未染色の対照細胞またはアイソタイプコントロールを使用して、実行可能なリンパ球ゲート（FSC対SSC）の位置を調整します。各軸上で最初の十年以下の人口を（ゲインの設定を変更することで）中心で全てのチャネルからの自家蛍光を削除します。
- 単一のカラーコントロールチューブ、それぞれ単一の色の正しい象限内の中央イベント（補正の設定を変更することによって）使う。
- 無関係な四量体で染色したチューブを使用して計測器の設定の微調整を行う。四量体は、多くの場合、抗体のコントロールよりも明るく染色ので、PEのチャネルのための特定の設定で調整が必要な場合があります。無関係な四量体は、CD4 +細胞の<0.5％を染色してください。
- 各チューブのデータを取得する
- 各サンプル管と陰性コントロールの管のためのイベントを収集
- 的考察のための少なくとも20,000のイベントを取得し保存
- データを分析する
- インポートデータファイルのFACS解析ソフトウェア（例えばCellQuestソフトウェア、WinMDI、またはFlowJo）へ。無関係な四量体を使用してチューブのステンドグラスを使用して、分析を開始します。
- プロットFSC対SSCとライブリンパ球（図1、左上のパネル）の周りゲートを描きます。
- プロットのCD4対CD3（ライブリンパ球のみを表示するためにゲート）とCD3 +とCD4 +集団（図1右上のパネル）の周りにゲートを描きます。
- プロットのCD4対テトラマー（のみCD3 +リンパ球を表示するためにゲート）とは、象限の境界を設定するようにCD4 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1の左下のパネル）である。
- プロットCD25対テトラマーおよびCD25 +テトラマー+人口が0.5％未満（図1右下のパネル）になるように象限の境界を設定する（CD4 +リンパ球のみを表示するためにゲート）。
- ゲートを変更することなく、サンプルチューブのすべてを分析する。
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図1代表的な負の制御テトラマー染色の結果。左上のパネルは、前方散乱の詩の側方散乱およびリンパ球サイズのゲート（R1）を示します。右上のパネルには、R1のゲートであり、ANT - CD4対抗CD3およびCD3 +（R2）とCD4 +（R3）のゲートを示しています。左下のパネルには、R2のゲートであり、四量体に対する抗CD4を示しています。右下のパネルには、R3のゲートであり、抗CD25対四量体を示しています。両方の四量体のプロットのための象限は、0.5％に設定されていました。
6。代表的な結果
- テトラマー陽性細胞は、拡張されたCD4 +細胞（図2）の間で別個の人口である必要があります。
- テトラマー陽性細胞は、通常、CD25 +と頻繁にCD4高い。
- いくつかのケースでは、MHC /ペプチドの組み合わせは、バックグラウンド染色を（多くの場合、溶解性が悪いとペプチドによって引き起こされる）与えることができます。 "偽陽性"細胞はテトラマー対CD4またはCD25対テトラマープロット（図3）のいずれかの単一の明確な集団ではないので、そのようなバックグラウンド染色は真陽性から区別することができます。
図2。代表正テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。テトラマー陽性細胞は抗CD25対四量体のパネル上で四量体のパネルと異なるCD25 +集団に対する抗CD4で異なるCD4高い人口として表示されます。
図3。代表"偽陽性"テトラマー染色の結果。パネルのレイアウトとゲーティング戦略は、図1と同一です。四量体のパネルに対する抗CD4は、不明瞭な"古墳"染色を示す。抗CD25対四量体はまた、CD25 +であることに向かって明確な傾向がある"古墳"染色を示しています。
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Discussion
免疫にCD4の役割+ T細胞を理解することは基本的に重要である。しかしながら、抗原特異的CD4 + T細胞が検出し、従来の方法を使用して分離することが困難な場合があります。対照的に、MHCクラスIIテトラマーは、所望の抗原特異性とCD4 + T細胞の直接可視化を可能にする。このビデオでは、分離、精製、およびCD4 + T細胞および四量体を使用して、その後の可視化のin vitro増幅を示しています。クラスIIテトラマーは、蛍光標識ストレプトアビジンのコア（図4）周りの共役可溶性ビオチン化クラスIIα/β二量体から成る複合体蛍光タンパク質です。このビデオで使用される四量体は、昆虫細胞培養（1）を使用してベナロヤホール研究所Teramerコア研究所によって製造された。これらの四量体を0.5 mg / mLの溶液として調製されており、6月18日月間4℃で保存することができる。四量体は、凍結融解、ストレスが取り除かれsteptavidinのコアからのPEのラベルを取り除くことができるように、凍結しないでください。クラスIIの染色試薬は、いくつかのソースから取得することができます（表1）および四、"ultimers"、およびマルチマーとして指定されています。それは四量体のアッセイ手順ここで説明するが、クラスI四量体のために使用される手続きとは異なることに留意すべきである。クラスIテトラマー染色は、通常、4℃が最適です° C、クラスIIテトラマー染色は、一般的に37を必要としながら℃にCD4と比較して、クラスIテトラマーためCD8の強力な協力効果のクラスIIテトラマーよりもT細胞に、より緊密に結合する。四量体アッセイは、ここで説明する外国または自己抗原のいずれかの特異的T細胞の可視化に有効であるが、相互作用の強さは、自己抗原に対して本質的に低くなります。アッセイのいくつかのバリエーションが可能です。例えば、CD4 + T細胞は、（メモリになどとナイーブな個体群）より前の刺激にさらに分画することができる、完全なタンパク質またはペプチドのプール（2）を用いて刺激、または様々な治療法は、抗原に対する影響を測定するために異なるウェルに添加することができる特定の応答。各ウェルの一部のみが四量体の分析に必要なため、残りの細胞は、ソートまたは他の目的のために確保するための四量体で染色できます。個々の実験のセットアップは、サンプルの特性によってと頼まれて科学的な質問で両方決定されます。設計の目的のために、これは拡張のために使用されるエピトープに影響を与えるであろうし、使用する必要があります、対応する四量体を決定するため、献血者のHLA型を知ることが重要です。病気や予防接種状況の知識はまた、結果の解釈に重要かもしれない。不健康な細胞は非常に悪い結果を与えることができるので、慎重に、増幅ステップ中に細胞を維持することが重要です。また、適切なマシンのセットアップ、ゲーティングおよびネガティブコントロールは、高品質のフローサイトメトリーの結果を得るために極めて重要です。
図4。MHCクラスIIテトラマーの模式図。赤コアは、ストレプトアビジン- PE分子を表しています。緑と黒の拡張機能は、MHCクラスIIα/β二量体を表しています。複合体がビオチンとストレプトアビジンとの間に高親和性相互作用によって結合されている。
表1：クラスIIの染色試薬の様々な情報源
| 四量体のソース | 製品の種類 | ウェブアドレス |
| ベックマンコールター | 四量体 | www.beckman.com |
| NIHテトラマー施設 | 四量体 | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| ベナロヤホール研究所 | マルチマー | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
私たちは、撮影とビデオ制作におけるそれらの重要な役割のためにディックフォーリーやリーキンボールに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
