Summary
यह प्रक्रिया शुद्धि को दर्शाता है और विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4 + पूरी परिधीय रक्त और उनके दृश्य का उपयोग कर MHC वर्ग द्वितीय tetramers से टी कोशिकाओं की इन विट्रो विस्तार में. Tetramers एक एकल प्रतिजन विशिष्टता और परिभाषित MHC वर्ग द्वितीय प्रतिबंध के साथ टी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट.
Abstract
प्रमुख उतक अनुरूपता परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय tetramers विशिष्ट प्रतिजन CD4 के प्रत्यक्ष दृश्य + प्रवाह cytometry द्वारा टी कोशिकाओं की अनुमति देते हैं. इस विधि पेप्टाइड लोड MHC और इसी टी सेल रिसेप्टर के बीच अति विशिष्ट बातचीत पर निर्भर करता है. जबकि एक एक अणु / MHC पेप्टाइड की आत्मीयता कम है, पार से जोड़ने streptavidin साथ MHC / पेप्टाइड परिसरों बातचीत की उत्सुकता बढ़ अभिकर्मकों धुंधला के रूप में उनके उपयोग को सक्षम. सीडी 4 + टी कोशिकाओं (~ एक एक एकल विशिष्टता के लिए 300,000 में) की अपेक्षाकृत कम आवृत्तियों की वजह से इन विट्रो प्रवर्धन चरण में इस परख इस्तेमाल करने के लिए पता लगाने की दहलीज वृद्धि. Mononuclear कोशिकाओं परिधीय रक्त से Ficoll बुनियाद द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. सीडी 4 + कोशिकाओं तो नकारात्मक biotinylated एंटीबॉडी कॉकटेल और विरोधी - बायोटिन लेबल चुंबकीय मोतियों का उपयोग चयन के द्वारा अलग कर रहे हैं. अंश CD4 सेल से पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग के रूप में प्रतिजन कोशिकाओं, सीडी 4 + टी कोशिकाओं मीडिया में एक प्रतिजनी पेप्टाइड और आईएल -2 जोड़कर विस्तार कर रहे हैं पेश. विस्तार कोशिकाओं को इसी वर्ग द्वितीय tetramer के साथ एक घंटे के लिए 37 सी में incubating और बाद में दाग ऐसे विरोधी CD4, विरोधी CD3, और विरोधी CD25 के रूप में सतह एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग हैं. लेबलिंग के बाद, कोशिकाओं को सीधे प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया जा सकता है. tetramer सकारात्मक कोशिकाओं को आमतौर पर विस्तार + CD4 कोशिकाओं के बीच एक विशिष्ट जनसंख्या के रूप में. Tetramer सकारात्मक कोशिकाओं आम तौर पर कर रहे हैं CD25 + और अक्सर CD4 उच्च. क्योंकि पृष्ठभूमि tetramer धुंधला के स्तर पर भिन्न हो सकते हैं, सकारात्मक धुंधला परिणाम हमेशा एक अप्रासंगिक tetramer के साथ ही कोशिकाओं का धुंधला तुलना में किया जाना चाहिए. इस बुनियादी परख के एकाधिक बदलाव संभव हैं. Tetramer सकारात्मक कोशिकाओं आगे प्ररूपी विश्लेषण ELISPOT या प्रसार assays में शामिल, या अन्य माध्यमिक assays के लिए हल किया जा सकता है. कई समूहों को भी सह धुंधला tetramers और या तो साइटोकाइन विरोधी या विरोधी FoxP3 एंटीबॉडी का उपयोग कर दिखा दिया है.
Protocol
1. परिधीय रक्त mononuclear सेल अलगाव (PBMC)
- एक खून का नमूना प्राप्त करना - सीरिंज या रक्त नलियों में रक्त एकत्र किया जाना चाहिए और विरोधी हेपरिन (01:50 अनुपात) के साथ coagulated थक्के रोकने के लिए. के बारे में 1 × रक्त के एमएल प्रति 10 6 PBMC की उपज की अपेक्षा के बारे में 40% जिनमें से CD4 पॉजिटिव (सीडी 4 +) टी कोशिकाओं को किया जाएगा.
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब, ट्यूब प्रति 25 एमएल में रक्त विभाज्य. यदि रक्त अलग है, धीरे aliquoting पहले मिश्रण करने के लिए प्लाज्मा वितरित
- पीबीएस जोड़ें, 40 एमएल और Ficoll की 11 एमएल की ड्राइंग द्वारा बुनियाद कुल मात्रा लाने, रक्त ट्यूब में डालने, और ध्यान विंदुक से pipet सहायता को हटाने. ficoll धीरे ट्यूब के तल में पलायन होगा. एक बार स्तर equalized है, धीरे धीरे रक्त ट्यूब से विंदुक हटाने और त्यागने.
- रक्त नलियों कैप और Aerosolve कनस्तरों में चलते हैं. कोई ब्रेक - मजबूती कनस्तरों और 900 पर अपकेंद्रित्र × छ 20 मिनट के लिए बंद. यह महत्वपूर्ण है कि कोई ब्रेक के इस स्पिन के अंत में लागू किया जाता है ब्रेकिंग फोर्स के रूप में कोशिकाओं की परत को परेशान करेंगे.
- स्पिन के बाद, PBMCs पीले प्लाज्मा (ऊपर) और पारदर्शी ficoll (नीचे) के बीच एक अलग सफेद परत फार्म चाहिए. धीरे से सफेद रक्त कोशिका परत एक हस्तांतरण विंदुक और नया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण का उपयोग कर मलाई उतारा. कुछ प्लाज्मा और Ficoll PBMCs साथ तैयार हो सकता है, लेकिन किसी भी लाल कोशिका परत के ड्राइंग से बचने के. आमतौर पर दो रक्त नलियों इस कदम पर एक सेल ट्यूब में जोड़ा जा गोली आकार में वृद्धि कर सकते हैं.
- Aerosolve कनस्तरों में कम ब्रेक - Pbs, 50 एमएल और अपकेंद्रित्र के लिए 500 पर कुल मात्रा लाने × 15 मिनट के लिए छ जोड़ें.
- एक पाश्चर विंदुक का उपयोग तरल Aspirate ख्याल रख रही गोली परेशान नहीं
- प्रत्येक ट्यूब 5-6 एमएल जोड़ने और धीरे clumps हटायें मिश्रण द्वारा रक्तलायी बफर के साथ समझो. अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- 10 मिनट के लिए Pbs, 50 एमएल और अपकेंद्रित्र 230 पर कुल मात्रा लाने × छ जोड़ें - कम ब्रेक. Aerosolve कनस्तरों अब कोई इन धीमी spins के लिए आवश्यक हैं.
- दो बार धो: Aspirate तरल एक पाश्चर विंदुक का उपयोग, 10 मिनट के लिए पीबीएस और अपकेंद्रित्र के साथ ट्यूब 230 × छ पर भरने.
- अंतिम धोने कदम के लिए पहले, फिर से निलंबित कोशिकाओं के एक विभाज्य निकालने के लिए, trypan नीले के साथ पतला है, और एक hemocytometer का उपयोग गिनती. यह कोशिका गिनती टी सेल जुदाई चरण में इस्तेमाल किया अभिकर्मक मात्रा हुक्म चलाना होगा.
2. सीडी 4 + टी सेल जुदाई *
- तरल Aspirate और 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति 40 उल कुल मात्रा लाने के लिए चल बफर जोड़ने. आमतौर पर यह बफर के 30 उल अधिक अवशिष्ट गोली मात्रा की आवश्यकता है.
- इस मात्रा को एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण.
- बर्फ पर 10 मिनट के लिए 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति 10 उल, टोपी ट्यूब, और जगह - CD4 अलगाव किट से एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें
- ट्यूब बर्फ से निकालें टोपी हटायें, और 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति बफर चलाने का 30 उल जोड़ें
- सीडी 4 अलगाव किट से चुंबकीय मोतियों जोड़ें - 10 मिलियन कोशिकाओं प्रति 20 उल, टोपी ट्यूब, और बर्फ पर 15 मिनट के लिए जगह
- बफर चल धोने और 10 मिनट के लिए 230 × छ पर अपकेंद्रित्र के दस खंडों में जोड़ें.
- स्पिन के दौरान, और अपने कार्यक्षेत्र में 5 एमएल polypropylene ट्यूब चुंबक सेट
- सेल गोली से तरल Aspirate, 2 एमएल चल बफर जोड़ने और हटाने के एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग clumps
- वही हस्तांतरण विंदुक का उपयोग, 15 मिनट के लिए 5 एमएल ट्यूब और सेते में कोशिकाओं चुंबक में हस्तांतरण
- ध्यान सीडी 4 छानना + एक के रूप में चिह्नित 15 एमएल ट्यूब में inverting चुंबक द्वारा सेल अंश और सभी लेकिन पिछले ड्रॉप खाली
- 5 एमएल ट्यूब बफर चलाने का एक और 2 एमएल जोड़ें और चुंबक से हटाने
- धीरे बंद ट्यूब और एक चिह्नित 15 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण के पक्ष CD4 कोशिकाओं कुल्ला
- प्रत्येक ट्यूब 2 एमएल टी सेल मध्यम जोड़ें, 230 × छ पर 10 मिनट के लिए सेल गिनती और अपकेंद्रित्र के लिए aliquots हटायें.
- Trypan नीले के साथ सेल aliquots पतला और एक hemocytometer का उपयोग गिनती. इन कोशिकाओं की गिनती विस्तार संस्कृति कदम के लिए प्रयोग किया जाता कुओं की संख्या हुक्म चलाना होगा.
2.11 - * वैकल्पिक रूप से, एमएसीएस स्तंभों और मोती (Miltenyi बायोटेक), AutoMACS कक्ष विभाजक (Miltenyi बायोटेक), या Robosep कक्ष विभाजक (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज) 2.2 कदम की जगह के निर्देश बनाती अनुसार किया जा सकता है.
3. इन विट्रो विस्तार संस्कृति में
- सीडी 4 से तरल Aspirate + और CD4 सेल छर्रों और कोशिकाओं की गिनती के आधार पर, संस्कृति मीडिया (आमतौर पर 3 मिलियन सीडी 4 + एमएल प्रति कोशिकाओं और 10 मिलियन एमएल प्रति CD4 कोशिकाओं संस्कृति को स्थापित करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है) को जोड़ने. विस्तार संस्कृति 3-5 लाख प्रति अच्छी तरह से CD4 कोशिकाओं और 2-3 मिलियन सीडी 4 + अच्छी तरह से प्रति एक 48 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में 1 एमएल संस्कृति मीडिया के एक कुल मात्रा में कोशिकाओं की आवश्यकता है. आमतौर पर, सीडी 4 + कोशिकाओं सीमित जनसंख्या
- अगर वांछित, CD4 कोशिकाओं (रेड ५००० चमकाना ओं). विभाज्य एक 48 प्रत्येक के लिए 300-500 μL जोड़कर अच्छी तरह से थाली पर कुओं की उपयुक्त संख्या में सीडी 4 कोशिकाओं. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए थाली प्लेस. प्रतिजन कोशिकाओं के रूप में विस्तार संस्कृति में पक्षपाती सीडी 4 - कोशिकाओं की सेवा करेंगे.
- इनक्यूबेटर से थाली निकालें.
- ताजा मीडिया के 500 उल जोड़ने और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 12-20 बार एक हस्तांतरण pipet का उपयोग और तरल के सभी हटाने के द्वारा कुओं धो लें. यह धोने पक्षपाती प्रतिजन कोशिकाओं पेश की एक परत के पीछे छोड़ देंगे.
- जब धोने पूरा हो गया है, बस पर्याप्त मीडिया को जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से नीचे (लगभग 100 उल) गीला - अन्यथा पक्षपाती कोशिकाओं बाहर सूख जाएगा
- हर अच्छी तरह से 2-3 मिलियन सीडी 4 + कोशिकाओं जोड़ें. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त मीडिया को जोड़ने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर 1 एमएल में कुल मात्रा लाने के लिए.
- प्रत्येक अच्छी तरह से वांछित पेप्टाइड जोड़ें. उत्तेजना के लिए ठेठ एकाग्रता 10 स्नातकीय / एमएल अंतिम है.
- 7 दिनों के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
- 7 दिनों के बाद, Hemogen के 50 उल जोड़ने आईएल -2 (या पुनः संयोजक आईएल 10, 2 / आइयू एमएल जैसे समकक्ष) प्रत्येक अच्छी तरह से.
- प्रत्येक बाद के दिन पर, सेल विकास का उपयोग कर एक खुर्दबीन की निगरानी. कुओं कि अभी तक मीडिया के आधे से हटाने के द्वारा मिला हुआ नहीं कर रहे हैं, ताजा मीडिया और आईएल -2 के 50 उल जोड़ने फ़ीड. Resuspending कोशिकाओं, कोशिकाओं के आधे से एक खाली अच्छी तरह से करने के लिए चलती है, ताजा मीडिया और आईएल -2 के 50 उल जोड़ने से मिला हुआ कुओं भाजित. इनक्यूबेटर करने के लिए कोशिकाओं वापसी.
- विस्तार कोशिकाओं tetramer के लिए तैयार संस्कृति के 13-15 दिनों के बाद हो जाएगा.
4. Tetramer धुंधला द्वारा टी कोशिकाओं Visualizing
- खरीद या इकट्ठा करने के लिए tetramers पेप्टाइड / MHC संयोजन है कि उत्तेजित सीडी 4 + टी कोशिकाओं (tetramer अभिकर्मकों के स्रोतों के लिए चर्चा देखें) मैच मैच. Tetramers ~ 0.5 मिलीग्राम / एमएल समाधान होना चाहिए.
- इनक्यूबेटर से थाली निकालें
- ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के आधे से आकर्षित
- एक 5 एमएल polystyrene FACS ट्यूब में स्थानांतरण - आम तौर पर 75 μL या के बारे में 50,000 कोशिकाओं - एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के एक विभाज्य
- - आमतौर पर 50 μL कुल मात्रा प्रति 1 μL - और 37 में जगह 1-2 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर tetramer जोड़ें. यह भी सलाह है कि प्रत्येक अच्छी तरह से एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक बेमेल tetramer के साथ कोशिकाओं के एक दूसरे विभाज्य दाग.
- विरोधी CD3 विरोधी सीडी 4, प्रत्येक एंटीबॉडी के 3-10 μL जोड़कर और विरोधी CD25 एंटीबॉडी के साथ लेबल की कोशिकाओं. अतिरिक्त या वैकल्पिक एंटीबॉडी मार्करों में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, पीई लेबल एंटीबॉडी का उपयोग नहीं के बाद से इस चैनल tetramers के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए है. इस समय, यह भी लेबल एकल रंग या निर्धारण अतिरिक्त कोशिकाओं का उपयोग नियंत्रण.
- सेते बर्फ पर या 4 में 15-30 मिनट के लिए प्रतिरक्षी कोशिकाओं लेबल डिग्री सेल्सियस
- 0,5 करने के लिए 2 एमएल 230 × छ पर 10 मिनट के लिए बफर और अपकेंद्रित्र चल रहा है के साथ प्रत्येक ट्यूब धो लें.
- ध्यान FACS ट्यूब से छानना तरल. बाद FACS विश्लेषण के लिए एक कवर कंटेनर (अधिमानतः बर्फ पर) में सभी ट्यूबों स्टोर.
5. प्रवाह cytometer अधिग्रहण और विश्लेषण
- फ्लो संदर्भ मोती का उपयोग cytometer जांचना.
- साधन सेटिंग्स सत्यापित करें:
- अस्थिर नियंत्रण कक्षों या निर्धारण नियंत्रण का प्रयोग, व्यवहार्य लिम्फोसाइट फाटक (FSC बनाम एसएससी) के स्थान को समायोजित. सभी चैनलों से प्रत्येक अक्ष के पहले दशक के नीचे जनसंख्या (लाभ सेटिंग्स बदलकर) पर केंद्रित द्वारा ऑटो प्रतिदीप्ति निकालें.
- एकल रंग नियंत्रण ट्यूबों, प्रत्येक एकल रंग के लिए सही quadrants के भीतर केंद्र की घटनाओं (मुआवजा सेटिंग्स बदलकर) का उपयोग करना.
- साधन सेटिंग्स के ठीक समायोजन एक अप्रासंगिक tetramer के साथ दाग ट्यूब का उपयोग करो. पीई चैनल के लिए विशेष सेटिंग्स में समायोजन की जरूरत है क्योंकि tetramers अक्सर एंटीबॉडी नियंत्रण की तुलना में उज्जवल दाग सकता है. अप्रासंगिक tetramer <CD4 के 0.5% + कोशिकाओं दाग चाहिए.
- प्रत्येक ट्यूब के लिए डेटा का मोल
- प्रत्येक नमूना ट्यूब और नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब के लिए घटनाओं लीजिए
- अधिग्रहण और analysys के लिए कम से कम 20,000 घटनाओं को बचाने के
- डेटा विश्लेषण
- FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे CellQuest सॉफ्टवेयर, WinMDI, या FlowJo) में आयात डेटा फ़ाइलें. एक ट्यूब दाग का उपयोग कर एक अप्रासंगिक tetramer का उपयोग कर अपने विश्लेषण प्रारंभ.
- प्लॉट FSC बनाम एसएससी और जीना लिम्फोसाइटों (1 चित्रा, ऊपरी बाएँ पैनल) के चारों ओर एक फाटक को आकर्षित.
- प्लॉट बनाम CD3 CD4 और CD3 + और सीडी 4 के आसपास के फाटक को आकर्षित (जीना ही लिम्फोसाइटों दिखाने gated) + आबादी (चित्रा 1 शीर्ष सही पैनल).
- प्लॉट CD4 बनाम tetramer (CD3 + लिम्फोसाइटों केवल दिखाने के लिए gated) वृत्त का चतुर्थ भाग और सीमाएं निर्धारित ताकि CD4 + tetramer + जनसंख्या कम से कम 0.5% (चित्रा 1 नीचे बाईं पैनल) है.
- प्लॉट CD25 बनाम tetramer और वृत्त का चतुर्थ भाग सीमाओं इतना तय है कि CD25 + tetramer + जनसंख्या कम से कम 0.5% की (चित्रा 1 नीचे सही पैनल) है (सीडी 4 + लिम्फोसाइटों केवल दिखाने के लिए gated).
- फाटक को बदलने के बिना नमूना ट्यूबों के सभी विश्लेषण.
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चित्रा 1 प्रतिनिधि नकारात्मक नियंत्रण tetramer धुंधला परिणाम है. ऊपरी बाएँ पैनल आगे तितर बितर छंद ओर तितर बितर और लिम्फोसाइट आकार फाटक (R1) से पता चलता है. ऊपरी दाएँ पैनल R1 के लिए gated है और विरोधी-CD3 और CD3 + (R2) और सीडी 4 + (R3) फाटकों बनाम चींटी सीडी 4 से पता चलता है है. निचले बाईं पैनल R2 के लिए gated है और tetramer बनाम विरोधी सीडी 4 दिखाता है. निचले सही पैनल R3 के लिए gated है और विरोधी CD25 बनाम tetramer पता चलता है. दोनों tetramer भूखंडों के लिए quadrants 0.5% करने के लिए सेट किया गया.
6. प्रतिनिधि परिणाम
- tetramer सकारात्मक कोशिकाओं का विस्तार सीडी 4 + कोशिकाओं (चित्रा 2) के बीच एक विशिष्ट जनसंख्या होना चाहिए.
- Tetramer सकारात्मक कोशिकाओं आम तौर पर कर रहे हैं CD25 + और अक्सर CD4 उच्च.
- कुछ मामलों में, एक MHC / पेप्टाइड संयोजन पृष्ठभूमि धुंधला (अक्सर गरीब विलेयता के साथ एक पेप्टाइड की वजह से) दे सकते हैं. इस तरह की पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना एक सच सकारात्मक से विभेदित किया जा सकता है क्योंकि "झूठी सकारात्मक" कोशिकाओं tetramer या CD25 बनाम tetramer भूखंडों (चित्रा 3) बनाम या तो सीडी 4 पर एक एकल अलग आबादी नहीं कर रहे हैं.
चित्रा 2 प्रतिनिधि सकारात्मक tetramer धुंधला परिणाम. पैनल लेआउट और gating रणनीति चित्रा 1 के समान हैं. tetramer सकारात्मक कोशिकाओं tetramer और विरोधी CD25 बनाम tetramer पैनल पर एक अलग CD25 + जनसंख्या पैनल बनाम विरोधी सीडी 4 पर एक अलग सीडी 4 उच्च जनसंख्या के रूप में दिखाई देते हैं.
चित्रा 3 प्रतिनिधि "झूठी सकारात्मक" tetramer धुंधला परिणाम. पैनल लेआउट और gating रणनीति चित्रा 1 के समान हैं. tetramer पैनल बनाम विरोधी CD4 एक अस्पष्ट "mounded" धुंधला हो जाना दिखाता है. विरोधी CD25 बनाम tetramer भी CD25 + होने की ओर कोई स्पष्ट प्रवृत्ति के साथ "mounded" धुंधला हो जाना, दिखाता है.
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Discussion
प्रतिरक्षा में की भूमिका सीडी 4 + टी कोशिकाओं को समझना मौलिक महत्वपूर्ण है. हालांकि, विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4 + टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए और पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर अलग करना मुश्किल हो सकता है. इसके विपरीत, MHC वर्ग द्वितीय tetramers वांछित प्रतिजन विशिष्टता के साथ सीडी 4 + टी कोशिकाओं की प्रत्यक्ष दृश्य अनुमति देते हैं. यह वीडियो अलगाव, शुद्धि, सीडी 4 + टी कोशिकाओं और उनके बाद tetramers का उपयोग दृश्य के इन विट्रो प्रवर्धन में और दर्शाता है. द्वितीय श्रेणी tetramers फ्लोरोसेंट प्रोटीन conjugates घुलनशील biotinylated वर्ग द्वितीय α / β एक फ्लोरोसेंट लेबल streptavidin कोर (चित्रा 4) के आसपास संयुग्मित dimers से मिलकर कर रहे हैं. इस वीडियो में इस्तेमाल किया tetramers Benaroya अनुसंधान संस्थान में Teramer कोर प्रयोगशाला कीट सेल संस्कृतियों (1) का उपयोग द्वारा उत्पादित थे. ये tetramers एक 0.5 मिलीग्राम / एमएल समाधान के रूप में तैयार कर रहे हैं और 4 ° C से कम 6-18 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. Tetramers जमे हुए कभी नहीं हो के रूप में फ्रीज पिघलना तनाव steptavidin कोर से पीई लेबल पट्टी दूर हो सकता है चाहिए. कक्षा द्वितीय धुंधला अभिकर्मकों कई स्रोतों (तालिका 1) से प्राप्त किया जा सकता है और tetramers, "ultimers", और multimers के रूप में नामित कर रहे हैं. यह नोट किया जाए कि tetramer परख प्रक्रिया यहाँ वर्णित वर्ग मैं tetramers के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं से अलग है चाहिए. कक्षा मैं tetramer धुंधला हो जाना आम तौर पर 4 में इष्टतम है डिग्री सेल्सियस, जबकि वर्ग द्वितीय tetramer धुंधला हो जाना आम तौर पर 37 की आवश्यकता डिग्री सेल्सियस कक्षा मैं tetramers CD8 की मजबूत सहकारी प्रभाव की वजह से द्वितीय श्रेणी tetramers से टी कोशिकाओं को अधिक कसकर बाँध रूप में सीडी 4 की तुलना में. tetramer परख यहाँ वर्णित टी या तो विदेशी या आत्म प्रतिजनों के लिए विशेष सेल visualizing में प्रभावी है, लेकिन बातचीत की शक्ति स्वाभाविक आत्म प्रतिजनों के लिए कम है. परख की कई बदलाव संभव हैं. उदाहरण के लिए, सीडी 4 + टी कोशिकाओं आगे fractionated उत्तेजना के पहले हो सकते हैं (जैसे कि स्मृति में और भोले आबादी), एक पूरी प्रोटीन या पूल (2) पेप्टाइड का उपयोग प्रेरित है, या विभिन्न उपचार अलग कुओं में जोड़ा जा सकता प्रतिजन पर उनके प्रभाव को मापने के विशेष प्रतिक्रिया. के बाद से केवल एक अच्छी तरह के एक हिस्से tetramer विश्लेषण के लिए की जरूरत है, शेष कोशिकाओं सॉर्टिंग या अन्य प्रयोजनों के लिए आरक्षित करने के लिए tetramer के साथ दाग कर सकते हैं. प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के लिए सेटअप दोनों नमूने की विशेषताओं और वैज्ञानिक सवाल पूछा जा रहा द्वारा तय किया जाएगा. डिजाइन प्रयोजनों के लिए यह रक्त दाता के एचएलए प्रकार पता करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि इस विस्तार के लिए इस्तेमाल किया epitopes प्रभाव और इसी tetramer है कि इस्तेमाल किया जाना चाहिए हुक्म चलाना होगा. रोग प्रतिरक्षण या स्थिति का ज्ञान भी परिणाम की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान प्रवर्धन कदम के दौरान कोशिकाओं को बनाए रखने के बाद से अस्वस्थ कोशिकाओं को बहुत खराब परिणाम दे सकते हैं. इसके अलावा, उच्च गुणवत्ता प्रवाह cytometry परिणाम प्राप्त करने के लिए उचित मशीन सेटअप gating, और नकारात्मक नियंत्रण vitally महत्वपूर्ण हैं.
चित्रा 4 MHC वर्ग द्वितीय tetramer के योजनाबद्ध. लाल कोर अणु streptavidin पीई का प्रतिनिधित्व करता है. हरे और काले एक्सटेंशन MHC वर्ग द्वितीय α / β dimers प्रतिनिधित्व करते हैं. जटिल बायोटिन और streptavidin के बीच उच्च आत्मीयता बातचीत के द्वारा शामिल हो गए है.
तालिका 1: वर्ग द्वितीय धुंधला अभिकर्मकों के विभिन्न स्रोतों
| Tetramer स्रोत | उत्पाद प्रकार | वेब पता |
| Beckman कल्टर | Tetramers | www.beckman.com |
| एनआईएच tetramer सुविधा | Tetramers | / www.research.yerkes.emory.edu tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya अनुसंधान संस्थान | Multimers | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
हम फिल्म और वीडियो उत्पादन में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए डिक Foley और Leigh Kimball धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
