Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Icke-radioaktivt På plats Hybridisering protokollet som gäller för Norge gran och en rad arter

Published: April 17, 2009 doi: 10.3791/1205
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Evolutionary Functional Genomics, Evolutionary Biology Center, Uppsala University, 2Department of Plant Biology and Forest Genetics, Uppsala BioCenter, Swedish University of Agricultural Sciences

Summary

Vi beskriver en modifierad DIG

Abstract

Den high-throughput expressionsanalys teknik som finns idag ger forskarna ett överflöd av uttryck profiler, men deras upplösning i form av vävnad särskilt uttryck är begränsat på grund av problem i dissekera enskilda vävnader. Uttryck uppgifter måste bekräftas och kompletteras med uttrycket mönster med hjälp av t ex in situ hybridisering, en teknik som används för att lokalisera cellspecifik mRNA uttryck. In situ hybridisering metod är mödosamt, tidskrävande och kräver ofta omfattande optimering beroende på art och vävnad. In situ-försöken är relativt svårare att utföra i Woody arter som barrträd Norge gran (Picea abies). Här presenterar vi en modifierad DIG in situ hybridisering protokollet, som är snabb och tillämpas på ett brett spektrum av växtarter, inklusive P. abies. Med bara några få justeringar, inklusive förändrat RNase behandling och proteinas K koncentration, skulle vi kunna använda protokollet för att studera vävnad särskilt uttryck för homologa gener i manliga könsorgan i en gymnospermerna och två arter gömfröiga växter, s. abies, Arabidopsis thaliana och Brassica napus. Protokollet fungerade lika bra för de arter som studerats och gener. AtAP3 och BnAP3 observerades i andra och tredje whorl blommig organ i A. thaliana och B. napus och DAL13 i microsporophylls av manliga kottar från P. abies. För P. abies det proteinas K koncentration, som används för att permeablize vävnaderna, var tvungen att höjas till 3 g / ml istället för 1 g / ml, möjligen på grund av mer kompakt vävnader och högre nivåer av fenoler och polysackarider. För alla djurslag RNas behandlingen togs bort på grund av minskad signalstyrka utan motsvarande ökning i specificitet. Genom att jämföra vävnad specifikt uttryck mönster av homologa gener från både blommande växter och ett barrträd vi visa att DIG på plats protokoll presenteras här, med endast minimala justeringar, kan appliceras på en mängd olika växtarter. Därför undviker protokollet både omfattande artspecifika optimering och det mödosamma användning av radioaktivt märkt sonder till förmån för DIG märkta prober. Vi har valt att illustrera den tekniskt krävande stegen i protokollet i vår film.

Anna Karlgren och Jenny Carlsson bidragit lika för denna studie.

Motsvarande författare: Anna Karlgren vid Anna.Karlgren @ ebc.uu.se och Jens F. Sundström vid Jens.Sundstrom @ vbsg.slu.se

Protocol

Denna icke-radioaktiva mRNA in situ hybridisering protokollet är optimerat för Norge gran vävnader och beskrivs i detalj. Den är baserad på en Arabidopsis / raps in situ hybridisering protokoll optimerat i våra grupper, som i sin tur baseras på protokoll från Meyerowitz och irländska labb och optimerad av Vivian irländska, Cindy Lincoln och Jeff Long bland andra 1-4.

FÖRFARANDE

1. Fixering och inbäddning

För att ge RNA behålla vävnader måste fixerade och inbäddade i vax innan en in situ experiment utförs. För fixering och bädda är ett kritiskt steg, eftersom dåligt fast material kan ge en låg eller icke detekterbar signal även om mRNA är mycket riklig. Vävnaderna är uttorkad, röjda och inbäddade i vax i gradvisa förändringar för att undvika vävnadsskada. För att ytterligare undvika krympning och svullnad i cellerna 0,85% NaCl läggs till den första etanol stegen i uttorkning av Norge gran vävnader. Det är möjligt att lämna ut NaCl i etanol (det är t.ex. kvar ute i Arabidopsis / raps-protokollet). Den uttorkning steget under inbäddning kan utföras på is för att hålla RNas aktivitet på lägsta eller vid +4 ° C. I detta protokoll 4% paraformaldehyd fixa lösning innehåller 0,25% glutaraldehyd, som är tänkt att ge en bättre RNA behålla trots att vissa hävdar att det förmodligen inte gör någon skillnad (t.ex. att det är kvar ute i Arabidopsis / raps-protokollet). Troligtvis någon standard fixering och bädda protokollet kan användas. Som framgår under norsk gran bädda skiljer sig något från den Arabidopsis / raps protokollet.

1,1 dag 1 samla växtmaterial och paraformaldehyd fixering

  1. Samla växtmaterial av intresse och dissekera den vid behov. Håll vävnaderna på is och placera dem i iskallt fix-lösning (se recept nedan) direkt eller så snart som möjligt. OBS! Förvara på is hela tiden!
  2. Applicera vakuum med proverna tills paraformaldehyd börjar bubbla. Håll vakuum i upp till tre timmar (t.ex. 2 x 15 min för Arabidopsis och raps blommor vävnader eller en timme för Norge gran manliga strutar) och släpp vakuum långsamt. Vävnaderna är tänkta att sjunka efter det vakuum infiltration av fixativ, men för vissa vävnader som innehåller mycket luft är det inte möjligt (t.ex. Arabidopsis blommor). En bit gasbinda kan användas för att göra vävnader stanna i fixativ.
  3. Byt fixativ och inkubera vid 4 ° C över natten (~ 12-16 timmar) försiktigt skaka.

Alternativ 1

OBS! Norge gran inbäddning version nedan (steg 4-8). Se scintillation rör eller glasflaskor används, åtminstone i steg 5.

1,2 Dag 2 Dehydrering OBS! Norge gran inbäddning version.

  1. 0,85% NaCl 30 min på is
    50% EtOH + 0,85% NaCl 90 min på is
    70% EtOH + 0,85% NaCl 90 min på is
    Paus! Det är möjligt att stanna här och lagra vävnader i 70% EtOH + 0,85% NaCl vid +4 ° C i flera månader.
    85% EtOH + 0,85% NaCl 90 min +4 ° C
    95% EtOH (+ eosin) 90 min +4 ° C
    OBS! Eosin läggs till färga vävnaderna rosa gör dem lättare att upptäcka vid inbäddning och snittning men det kan uteslutas.
    100% EtOH (+ eosin) 90 min +4 ° C
    100% EtOH (+ eosin) natten +4 ° C

1,3 Dag 3 Dehydrering och inbäddning OBS! Norge gran inbäddning version.

    100% EtOH (+ eosin) 2 h rumstemperatur
    50% EtOH + 50% Histoclear II 1 h rumstemperatur
    100% Histoclear II 1 h rumstemperatur
    100% Histoclear II 1 h rumstemperatur
    50% Histoclear II + 50% Histowax natten 40-50 ° C
    OBS! I det sista steget koncentrationen av Histowax är inte avgörande, bara hälla i några vax marker.

1,4 Dag 4 Bädda OBS! Norge gran inbäddning version.

  1. 100% smält Histowax +60 ° C (Ändra morgon och kväll)

1,5 Dag 5 Bädda OBS! Norge gran inbäddning version.

  1. 100% smält Histowax +60 ° C (Ändra morgon och kväll)

1,6 Dag 6 Bädda OBS! Norge gran inbäddning version.

  1. 100% smält Histowax +60 ° C (Ändra morgon och kväll)
    OBS! Det är ok om vaxet ibland byts en gång om dagen, men sen tar det två dagar att slutföra en dag av förändringar. Vaxet förändring kan också fortsätta i två extra dagar utan problem. Detta rekommenderas för stora prover eftersom det bidrar infiltrationen av vaxet i mitten av dessa vävnader.

Alternativ 2

OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version nedan (steg 4-8).

1,2 Dag 2 Dehydrering OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version.

  1. OBS! Alla steg vid +4 ° C och försiktigt skaka om inte annat anges.
    1x PBS 30 min
    1x PBS 30 min
    30% EtOH 60 min
    40% EtOH 60 min
    50% EtOH 60 min
    60% EtOH 60 min
    70% EtOH 60 min
    Paus! Det är möjligt att stanna här och lagra vävnader i 70% EtOH vid +4 ° C i flera månader.
    85% EtOH 60 min
    95% EtOH (+ eosin) natten
    OBS! Eosin läggs till färga vävnaderna rosa gör dem lättare att upptäcka vid inbäddning och snittning men det kan uteslutas.

1,3 Dag 3 Dehydrering och embeddning OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version.

  1. OBS! Alla steg i rumstemperatur och försiktigt skaka om inte annat anges.
    100% EtOH (+ eosin) 30 min
    100% EtOH (+ eosin) 30 min
    100% EtOH (+ eosin) 60 min
    100% EtOH (+ eosin) 60 min
    OBS! Överför vävnaden skintillationsflaskor eller andra (glas) injektionsflaskor.
    75% EtOH + 25% Histoclear II 30 min
    50% EtOH + 50% Histoclear II 30 min
    25% EtOH + 75% Histoclear II 30 min
    100% Histoclear II 60 min
    100% Histoclear II 60 min
    100% Histoclear II + ¼ volymer Histowax chip över natten (inga skakningar)
    OBS! I det sista steget koncentrationen av Histowax är inte avgörande, bara hälla i några vax marker.

1,4 Dag 4 Bädda OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version.

  1. Placera rören med vävnader vid 42 ° C tills vaxet marker smälter helt. Tillsätt därefter ¼ volym vax chips och låt dem smälta helt. Flytta till +60 ° C och låt rören i flera timmar. Slutligen ersätter vax / Histoclear II med färska smält vax och inkubera över natten vid 60 ° C.

1,5 Dag 5 Bädda OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version.

  1. 100% smält Histowax +60 ° C (Ändra morgon och kväll)

1,6 Dag 6 Bädda OBS! Arabidopsis / raps inbäddning version.

  1. 100% smält Histowax +60 ° C (Ändra morgon och kväll)
    OBS! I den Arabidopsis / raps-protokollet (jämfört med Norge gran-protokollet) finns det en Dag 7 Bädda in på samma sätt som i dag 5-6, dvs 100% smälte Histowax vid 60 ° C och förändras morgon och kväll
    OBS! Det är ok om vaxet ibland byts en gång om dagen, men sen tar det två dagar att slutföra en dag av förändringar. Vaxet förändring kan också fortsätta i två extra dagar utan problem. Detta rekommenderas för stora prover eftersom det bidrar infiltrationen av vaxet i mitten av dessa vävnader.

1,7 Dag 7 inbäddning (Dag 8 i Arabidopsis / raps-protokollet) (Film! Teknisk information visas i filmen)

  1. Värm petriskålar och / eller mögel vid 60 ° C. Slå på en värmeplatta (+60 ° C) och se till att smälta Histowax är tillgänglig.
  2. Häll vävnader och smälte Histowax i en petriskål (eller mögel) placeras på den heta plattan. Lägg till fler Histowax så att vävnaderna omfattas. Värm en pincett och fördela vävnader jämnt i skålen. Fyll petriskål (eller mögel). Om vaxet stelnar innan vävnader är i rätt position, hetta upp det igen eller ta bort de härdade vax med den uppvärmda pincett.
  3. Låt vaxet blocket stelna i rumstemperatur innan den placeras vid +4 ° C. Det är bättre att göra flera vax block istället för att bädda in vävnader för hårt eftersom vaxet blocket skulle spricka när bitar skärs ut under snittning.
    Paus! Förvaras vid 4 &deg, C. Vävnaderna är stabila i flera år.
    OBS! Arbetet RNas fri från detta steg och framåt. Använd handskar, DEPC-treat MilliQ vatten, buffertar, glas mm, autoklav buffertar och baka glas etc. när så är lämpligt.

2. UPPDELNING (Film! Teknisk information visas i filmen)

  1. Slå på två kokplattor (+60 ° C och 42 ° C) och se till att smälta Histowax är tillgänglig.
  2. Hetta upp en skalpell och noggrant skära ut ett vax block av vävnad från petriskål (det kan spricka om man är för våldsam), eller ta bort den ur formen. När en enda vaxet block har skilts, forma biten till rätt storlek och form för att underlätta skärning i mikrotomen.
  3. Vaxet bit bör ha ett extra vax "klack" under vävnaden så att den kan fästas på blocket hållaren. Värm blocket hållaren och hälen på värmeplattan (+60 ° C) och säkring dem tillsammans. Det kan vara nödvändigt att sätta på en droppe Histowax II för att göra fusion stabil. Låt det härda vid +4 ° C.
  4. Skär vaxet blocket till 6-8 ìm tjocka sektioner anslutna i ett långt band med en mikrotomen.
    OBS! Detta blir lättare om vaxet blocket är kallt, dvs förvara vaxet blocket vid +4 ° C och föra den ur kylskåpet när du startar kapning. Det kan också vara fördelaktigt att hålla kniven kallt.
  5. Studera band över sektioner i ett förstoringsglas och markera de som ska användas.
  6. Sätt RNas-fri MilliQ-vatten på bilderna (Probe-On Plus från Fisher bioteknik, som är förrengöras och debiteras). Klippte bandet i mindre bitar och lägg dem ("Bakåt" eller "blanka" sidan nedåt) på bilderna. Bilderna med band bör placeras på en 42 ° C plattan. Bandet bör plana ut (detta är viktigt!) I vattnet. Låt avsnitten sitta i några minuter och sedan använda en Kimwipe / mjukpapper att tömma ur vattnet.
  7. Låt glasen på plattan i 1-2 timmar.
  8. Inkubera objektglasen vid 42 ° C över natten så att vävnaderna följer bilder.
    Paus! Det rekommenderas att använda delar så snart som möjligt, men de kan lagras torrt i stängda lådor med torkmedel upp till flera dagar vid 4 ° C.

3. Skapandet av sonder

In situ hybridisering upptäcker uttryck med hjälp av en märkt sond specifika för en viss mRNA. Sonden, som är oftast en bit av kompletterande RNA, kan märkas med digoxigenin, gräva. DIG är en liten molekyl som kan fästas uridin och därmed ingår i RNA sond och sedan detekteras med DIG-specifika antikroppar.

Utformning och tillverkning av sonden är den mest kritiska steget i en RNA-in situ hybridisering experiment. Försiktighet bör vidtas för att kontrollera att proben har en hög specificitet och är märkt med hög kvalitet UTPs. Ibland hybridisering temperatur och / eller reaktion längd måste anpassas för specifika sonder. Som alltid bör man undvika RNas kontamination.

Innan märkning, isolera en mall enligt din standard-protokoll, använda t.ex. cDNA kloner, PCR-fragment, och linjärisera mallen. Sense och antisens fragment är isolerade och förstärks från mallen med hjälp av genen specifika primers. För PCR-förstärkta fragment inte använda enzymer som producerar 3 "överhäng. Till alla fragment en T7 (eller SP6 eller T3) överhäng tillsätts med hjälp av primers bär på T7-sekvens eller med hjälp av en vektor med en T7-promotor.

Känslan (mRNA eller (-) sträng) sond har samma sekvens som målet mRNA och kommer inte att hybridisera till målet mRNA, medan antisense (anti-mRNA eller (+) sträng) sond har komplementära sekvensen och därmed hybridiseras till målet att ge en signal av intresse. Känslan sond används som negativ kontroll och ingen signal kommer att erhållas om experimentet fungerade. En positiv kontroll är också nödvändig, t.ex. en sond som upptäcker en hus-hålla-genen. Majoriteten av bilderna bör hybridiseras med antisense sonder, medan endast ett fåtal bilder bör hybridiseras till de olika kontroll sonder.

3,1 Probe märkning med hjälp av in vitro transkription

Reagenser från DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7, 11175025910, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) eller liknande som används vid märkning av sonder. Den 20 l reaktionen beskrivs här bör ge ~ 10 mikrogram av DIG-märkt RNA.

  1. Gör en in vitro transkription att införliva märkt nukleotider. Lägg till följande reagenser till ett rör (hålla på is):
    Ingrediens volym / mängd
    10 x NTP märkning blandning 2 l
    10 x Transkription buffert 2 l
    Protector RNas hämmare 1 l (20U)
    RNA-T7-polymeras (SP6 eller T3) 2 l
    Mall DNA (500-1000 ng) x l
    RNas-fri MilliQ-vatten y l, till en slutlig volym på 18 l
  2. Blanda NTP märkning blandningen, transkription buffert, RNas hämmare (OBS! om proben är kort, t.ex. <500bp, du kan öka RNas hämmaren koncentrationen till 40U), polymeras templat-DNA och vatten och sedan snabbt centrifugen.
  3. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 2 timmar (OBS! om proben är kort, t.ex. <500bp, öka tiden för att reagera 4-6 timmar).
  4. Tillsätt 2 l DNas jag och inkubera vid 37 ° C i 15 minuter.
  5. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 l 0,2 M EDTA (pH 8,0). Kolla produkten på gelen.
  6. Fällning sonden genom att tillsätta 2,5 l 4 M LiCl och 75 ìl av> 99,5% etanol. Blanda väl och inkubera vid -20 ° C över natten (OBS! Använd inte tRNA som bärare. Använd istället glykogen eller akrylamid beroende på tillverkare).
  7. Centrifugera (13 000 rpm) i 30 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten (minst 10 min 13 000 rpm) två gånger i 70% etanol (~ 150-300 l).
  8. Avlägsna supernatanten och låt pellets torr. Resuspendera sonden i 30 l RNase-fritt vatten i 1-2 timmar på is.
    Paus! Sonden kan förvaras vid -20 ° C i mer än ett år.
    OBS! Spara 0,5 l prover från steg 21 (före in vitro transkription), steg 23 (innan DNas behandling), steg 24 (efter DNas behandling, men innan nederbörden) och 1 l prov från steg 27 (när sonden har återsuspenderade). Kör prov på en nondenaturating 1% TBE gel. Om DNas reaktionen har fungerat mallen-bandet kommer att försvinna. In vitro transkription borde generera en tjock RNA band av ungefär rätt storlek. Om du ser flera band, denaturate proverna vid 80 ° C i 5 minuter följt av härdning på is före lastning. Om återhämtningen från steg 27 ser illa det kan vara så eftersom sonden inte var återsuspenderade bra. Inkubera RNA vid 55 ° C 5-10 minuter att få in det i lösning.

3,2 Hydrolys av långa sonder

OBS! Om din sond är större än 150 baspunkter det borde reduceras till 50-150 räntepunkter till att ge en hög signal, tack vare bättre penetration. Sonden kan brytas ned kemiskt i en karbonat buffert (pH 10,2). Om sonden är av rätt storlek hoppa över hydrolys steg, men kom ihåg att lägga en volym formamid, dvs 30 l, till sonden.

  1. Förbered 0,2 M natriumbikarbonat (NaHCO 3) och 0,2 M natriumkarbonat (Na 2 CO 3). Båda ska vara färsk.
  2. Testa två buffertar genom att blanda 5 ml H 2 O, 2 ml 0,2 M NaHCO 3 och 3 ml 0,2 M Na 2 CO 3. PH-värdet bör vara ~ 10,2.
  3. Beräkna inkubationstid:
    Inkubationstid (i minuter) = (L 0-L f) / (K * L 0 * L f)
    L 0 = start längden på sonden i kb
    L f = slutlig längd sonden på KB = t.ex. 0,100 kb
    K = hastighetskonstanten för hydrolys = 0,11 kb-1min-1
  4. Hydrolysera hälften av din sond, spara resten till senare. Späd sond till 50 l med RNas gratis vatten och tillsätt 20 l 0,2 M NaHCO 3 (först lägga till) och 30 l 0,2 M Na 2 CO 3. Blanda och inkubera vid 60 ° C för den beräknade inkubationstiden.
  5. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 l 1 M NaOAc pH 4,7.
  6. Fällning sonden genom att tillsätta 10 l 4 M LiCl 2 och 300 l ethanol (OBS! Använd glykogen eller akrylamid som bärare, om det behövs). Inkubera vid -20 ° C över natten.
  7. Centrifugera (13 000 rpm) i 30 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten två gånger i 70% etanol (~ 300 l). Centrifugera (13 000 rpm) i minst 10 min i varje tvätt vid +4 ° C.
  8. Avlägsna supernatanten och låt pellets torr. Resuspendera sonden i 30 l RNase-fri MilliQ-vatten. Lägg till en volym formamid, dvs 30 l, till sonden.
    Paus! Sonden kan förvaras vid -20 ° C i mer än ett år.
    OBS! Ta 2 ìl av unhydrolyzed givare och 2 ìl av hydrolyserat sond (innan formamid läggs till) och kolla på en nondenaturating 1% TBE gel. Det bör finnas en skillnad i storlek mellan de två proven. Givarna kan behöva denaturerad vid 80 ° C i 5 minuter följt av härdning på is före lastning.

4. In situ hybridisering (är Film! Teknisk information som visas i filmen)

Se till att alla lösningar är RNas gratis! Det är inte nödvändigt att DEPC-treat allt, men använd minst autoklaveras MilliQ-vatten. Se till att alla glas värms upp vid 200 ° C över natten eller i minst 5 timmar. Behandla plastbehållare och rör om barer med 0,1 M NaOH med agitation över natten. Skölj plastbehållare flera gånger med autoklaveras MilliQ-vatten (~ 500 ml / container). Det är viktigt att skölja behållarna varsamt för att undvika spår av NaOH som kan störa hybridisering. DEPC-behandla alla stamlösningar utom Tris-buffertar. Kontrollera alla lösningar etc. innan försöket att se att allt är tillgängligt. Fram till steg 61 (utom steg 51-52) Vi håller bilderna i ett rack, som enkelt flyttas mellan behållare.

4,1 In situ avsnitt förbehandling

  1. Deparaffinize / torka avsnitt:
    2x 10 min Histoclear II (använd glasbehållare)
    2x 1-2 min 100% EtOH
    1-2 min 95% EtOH
    1-2 min 90% EtOH
    1-2 min 80% EtOH
    1-2 min 60% EtOH
    1-2 min 30% EtOH
    1-2 min H 2 O
  2. Tvätta objektglasen i 15-20 min i 2x SSC i rumstemp (OBS! Förbered paraformaldehyd används i steg 42 under inkubationstiden).
  3. Behandla vävnader i 30 min med proteinas K vid 37 ° C under försiktig omrörning (t.ex. 1 mikrogram / ml för Arabidopsis / raps och 3 mikrogram / ml för Norge gran). Blanda och värm till 37 ° C 100 mM Tris pH 8 respektive 50 mM EDTA. Lägg proteinas K omedelbart före behandla bilder. OBS! Det proteinas K behandlingen behöver optimeras beroende på vävnad, växter och ålder. (OBS! Förbered trietanolamin används i steg 45 under inkubationstiden).
  4. Behandla bilderna i 2 min med 2mg/ml glycin i 1x PBS vid rumstemperatur. (OBS! Blanda glycin med PBS dagen innan den används för att säkerställa att glycin är ordentligt upplöst).
  5. Tvätta objektglasen i 2 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur.
  6. Tvätta objektglasen i 2 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur.
  7. Inkubera objektglasen i 10 minuter med 4% (w / v) paraformaldehyd (gjord färska) i 1x PBS pH 7 vid rumstemperatur. Använd glasbehållare.
  8. Tvätta objektglasen i 5 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur.
  9. Tvätta objektglasen i 5 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur. (Fördela ättiksyraanhydrid i lösningen i steg 45).
  10. Inkubera objektglasen i 10 minuter i 0,1 miljoner trietanolamin (gjord färska, pH 8) och ättiksyraanhydrid i rumstemperatur.
  11. Tvätta objektglasen i 5 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur.
  12. Tvätta objektglasen i 5 minuter i 1x PBS vid rumstemperatur.
  13. Torka:
    30 sek 30% EtOH
    30 sek 60% EtOH
    30 sek 80% EtOH
    30 sek 90% EtOH
    30 sek 95% EtOH
    2x 30 sek 100% EtOH
    Paus! Det är möjligt att stanna här och lagra bilder i en behållare med en liten mängd EtOH i botten på 4 ° C i flera timmar.

4,2 In situ hybridisering (Film! Teknisk information visas i filmen)

Bestäm vilka bilder att använda som sonder, glöm inte att använda både förnuft och sonder antisens samt en positiv kontroll. (OBS! ProbeOn Plus bilder från Fisher bioteknik har en vit glasyr som tillåter dem att vara inklämd i par under hybridisering / upptäckt steg i protokollet.) Samma prob med samma koncentration bör användas på en specifik bild par. Bestäm hur mycket hybridisering lösning för att göra baserat på det totala antalet glida par. Värm dextransulfat i 60 ° C. Den hybridisering Lösningen är mycket trögflytande från dextransulfat. Sätt hybridisering lösningen i 60 ° C och det blir lättare att hantera. Lufttorka glasen på rena pappershanddukar eller Kimwipe / mjukpapper innan sonden används. Bilderna måste vara helt torr. För varje par av bilderna lägga sonden. Det är viktigt att testa olika givare koncentrationer (t.ex. 0,5, 2 och 4 l) för att hitta den optimala koncentrationen innan själva experimentet är förformade.

Hybridisering lösning 5 Skjut par 10 skjut par 15 skjut par 20 skjut par
10x på plats salter 100 l 200 l 300 l 400 l
avjoniserat formamid 400 l 800 l 1200 l 1600 l
50% dextransulfat (+60 ° C) 200 l 400 l 600 l 800 l
50x Denhardt lösning 20 l 40 l 60 l 80 l
tRNA (100mg/ml) 10 l 20 l 30 l 40 l
H 2 O (DEPC behandlade) 70 l 140 l 210 l 280 l
Total volym 800 l 1600 l 2400 l 3200 l
  1. Späd sonden i RNase-fria MilliQ-vatten till en slutlig volym på 20 l. Lägg till en volym (dvs 20 l) formamid till sonden ger en total volym på 40 l. Värm sond till 80 ° C i 2 minuter. Placera på is i 2 min. Spinn ner. Håll sonden på is. Detta probe-blandning är nog för ett par bilder. Multiplicera enligt det totala antalet skjut par för den specifika givaren.
  2. Tillsätt 160 l av hybridisering lösning för varje par av bilder som ger en slutlig volym på 200 l (dvs 160 l hybridisering lösning + 40 l sond) för varje bild par. Blanda utan att generera bubblor.
  3. Applicera sonden till en bild och sakta smälta samman två bilder tillsammans. (OBS! sandwiching kan endast göras med Probe-On Plus diabilder eller motsvarande bilder. Om bilderna utan glasyr används använda täckglas istället för sandwiching.)
  4. Höj glider över våta pappershanddukar i en plastbehållare (som sluter helt tätt) med plastpipetter. Hybridisera 50-55 ° C över natten (12-16 timmar).

4,3 In situ inlägg hybridisering (Film! Teknisk information visas i filmen)

  1. Förbered på plats efter hybridisering genom att värma ~ 2 L 0,2 X SSC (+55 ° C) och ~ 2 L 1x NTE (+37 ° C) över natten. Mer Rymdbolaget och NTE behövs om RNas behandling (steg 57-59 nedan) utförs.
  2. Doppa varje bild par i varmt 0,2 X SSC (se ovan) för att separera och skölj dem. Sedan placera dem i ett rack i en containermed varm 0,2 X SSC.
  3. Tvätta objektglasen i 60 min i 0,2 X SSC försiktig omrörning vid 55 ° C. (OBS! Förbered Boehringer blocket lösning som används i steg 63 under inkubationstiden.)
  4. Upprepa wash i 0,2 X SSC i 60 min. (OBS! Om RNas steget utförs låta RNas tina under denna inkubation, om inte fortsätter till steg 60.)
  5. Tillval: Tvätta bilderna i 5 minuter i varmt 1x NTE (se ovan) vid 37 ° C under försiktig omrörning.
  6. Tillval: Upprepa tvätta i varmt 1x NTE i 5 min vid 37 ° C med varsam agtation.
  7. Tillval: Behandla bilderna med RNas (20 mikrogram / ml RNas A i 1x NTE) i 30 min vid +37 ° C under försiktig omrörning. Tvätta sedan i 5 min i 1x NTE vid +37 ° C under försiktig omrörning. Upprepa 1x NTE tvätt.
  8. Tvätta objektglasen i 60 min i 0,2 X SSC vid 55 ° C under försiktig omrörning. (OBS! Förbered blocket lösning som används i steg 64-65 och 67 under inkubationstiden.)
  9. Tvätta bilderna för 5 min i 1x PBS vid rumstemp (Pause! Du kan lagra bilder i 1XPBS vid 4 ° C över natten om du vill fortsätta nästa dag.)
  10. Placera glasen på botten av en stor plastbehållare med provet uppåt.
  11. Inkubera objektglasen med 1% Boehringer block i 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl i 45 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning. Bara täcka diabilder med den blockerande lösningen. Häll av den blockerande lösningen medan bilderna fortfarande är i plastbehållare eller placera bilderna i en ny behållare. När hälla ut lösningen på bilderna brukar hålla sig till plastbehållare, men se till att de inte ramlar ut från behållaren.
  12. Byt Boehringer blocket lösning med 1,0% BSA i 100 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% Triton X-100. Utför inkubationen i steg 63.
  13. Späd anti-gräva antikroppar (1:1250, dvs 8 l antikroppar i 10 ml BSA) i BSA / Tris / NaCl / Triton-lösning från steg 64. Gör en pöl av antikropp lösning i en plast väger skålen. Sandwich diabilder tillsammans för att kapillära krafter för att dra upp lösningen. Låt rinna av på Kimwipe / mjukpapper och upprepa, försök att undvika bubblor.
  14. Höj glider över våta pappershanddukar i plastbehållare och låta bilderna att sitta vid rumstemperatur i 2 timmar.
  15. Tappa diabilder på Kimwipe / mjukpapper och separat. Placera på botten av plastkärl som i steg 63. Tvätta 4x i BSA / Tris / NaCl / Triton lösning. 15 min varje gång, försiktig omrörning i rumstemperatur.
  16. 10 min 100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2. Placera på botten av plastkärl som i steg 63.
  17. Doppa bilden i Tris pH 9.5/NaCl/MgCl 2 lösning för att säkerställa alla tvättmedel tvättas bort.
  18. Gör smörgåsar och upprätta Western Blue lösning som i 65. Upprepa en gång.
  19. Placera objektglasen i plastbehållare ovanför blött hushållspapper i totalt mörker (linda in i folie) för 1-5 dagar i rumstemperatur. Kontrollera efter 6, 12 och 24 timmar därefter en gång varje dag.
  20. Tappa diabilder, skölj i 1xTE att stoppa reaktionen. Sätt på täckglas innan bilderna granskas i mikroskop. Bilderna kan sparas i 1x TE i flera månader men ta bilder så snart som möjligt.

RECEPT / Stamlösningar

OBS! Använd RNas-fri MilliQ-vatten så mycket som möjligt, t.ex. DEPC-treat MilliQ-vatten (Lägg till 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav (20 minuter vid 15 psi, dvs 1,05 kg / cm 2, på flytande cykel) eller användas vid Minst autoklaveras MilliQ-vatten. Vid förberedelserna buffertar och lösningar lager det är också möjligt att upplösa RNase-fria salter etc. i DEPC-behandlat vatten, i stället för DEPC-behandla buffertar och lösningar lager själva. Om du inte DEPC-treat vatten , buffertar och lager-lösningar, åtminstone autoklav eller filter sterilisera dem.
Paus! Förvara buffertar och lager-lösningar i rumstemperatur, om inte annat anges.
OBS! Du kan hitta många av de buffertar samt tips om hur man gör dem i molekylär kloning (Sambrook, J., och DW Russell. 2001. Molekylär Kloning Ett laboratorium Manuell. 3 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA).

Ättiksyraanhydrid 0,1 miljoner trietanolamin (pH 8, volym: 800 ml).

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Trietanolamin 10,4 ml 0,1 M trietanolamin
MilliQ-vatten 786,4 ml slutliga volymen 800 ml
HCl 3,2 ml ger pH8,0
Ättiksyraanhydrid 4,8 ml 0,6%
  • För att göra 0,1 M trietanolamin buffert, pH 8,0, späd 10,4 ml trietanolamin i 786,4 ml H 2 O och tillsätt 3,2 ml HCl till pH till 8,0 (kolla med pH-indikator).
  • Höj bilden rack med brutna 10 ml plastpipetter eller liknande i en behållare av trietanolamin med en omrörare i botten.
  • Fördela 4,8 ml ättiksyraanhydrid i trietanolamin några minuter innan du lägger bilderna i så att det blandas väl.

OBS! Gör 0,1 miljoner trietanolamin fräsch och ättiksyreanhydrid strax före inkubation.
OBS! Använd glasbehållare. Trietanolamin buffert måste användas eftersom ättiksyraanhydrid är instabilt i vatten.

Agarosen (1%) gel i 1 x TBE (volym: 100 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Agarosen 1 g 1%
1 x TBE upp till 100 ml

Blanda agaros med 1 x TBE. Värme / koka tills agarosen har smält. Lägg upp en gel. Kör gelen i en 1 x TBE-buffert.

Dextransulfat

Späd 5 g dextransulfat till 10 ml med DEPC-behandlade MilliQ-vatten (dvs 50% (w / v)) och lös upp i 60 ° C.
Paus! Förvara vid -20 ° C.

0,5 M EDTA pH8.0 (titriplex III, volym 500 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
EDTA (372,24 g / mol) 93,06 g 0,5 M EDTA
MilliQ-vatten upp till 500 ml
NaOH ~ 10 g pellets ger pH 8,0
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Lös EDTA i vatten (sker vid pH 8,0), anpassa sig till en slutlig volym på 500 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

Fix lösning / fixativ (steg 1-3, 42) - 4% (w / v) paraformaldehyd i 1x PBS, pH 7,0 (650 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
MilliQ-vatten 585 ml
10x PBS 65 ml 1x PBS
10M NaOH 520 l ger pH ~ 11
Paraformaldehyd 26 g 4%
Koncentrerad HCl 449 l ger pH ~ 7
  • Blanda vatten, PBS och NaOH och värme till 60-70 ° C (temperatur och höga pH gör det lättare att upplösa paraformaldehyd.
  • Lägg (i dragskåp) paraformaldehyd.
  • När lösningen har rensat placera den på is och justera pH till 7,0 genom att tillsätta 449 l koncentrerad HCl.

OBS! Gör fräsch.
OBS! I gran-protokollet glutaraldehyd lades till en slutlig koncentration av 0,25%, dvs 6,5 ml 25% glutaraldehyd att den totala volymen 650 ml eller 10 ml 25% glutaraldehyd att den totala volymen 1000 ml (kom ihåg att minska vattnet med en lika volym).
OBS! Tillsätt några droppar Tween 20 och / eller Triton X-100, efter pH-värdet ändras, för att minska ytspänningen för att underlätta fixering i steg 1-3. ANVÄND INTE i STEG 42!
OBS! Vid fastställandet plantvävnader en mindre volym (t.ex. 100 - 200 ml) av fixeringsvätska är i allmänhet behövs.

10x på plats salter (volym 100 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
5 M NaCl 60 ml 3M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8,0 10 ml 0,100 M Tris
1 M Na Fosfat pH 6,8 10 ml 0,100 M Na Fosfat
0,5 M EDTA 10 ml 0,050 M EDTA
MilliQ-vatten upp till 100 ml

Blanda en Na fosfatbuffert med pH 6,8 (46,3 ml 1 M Na 2 HPO 4 + 53,7 ml 1 M NaH 2 PO 4). Blanda NaCl, Tris, Na fosfatbuffert, EDTA och vatten. Autoklav. Paus! Förvara vid -20 ° C.

4 M LiCl 2 (litiumklorid, volym: 100 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
LiCl 2 (42,39 g / mol) 16,956 g 4M LiCl 2
MilliQ-vatten upp till 100 ml
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Lös LiCl 2 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 100 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.
Paus! Förvaras vid 4 ° C.

1 M MgCl 2 · H 2 O (magnesiumklorid, volym: 100 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
MgCl 2 · H 2 O (203,30 g / mol) 20,33 g 1 M MgCl 2 · H 2 O
MilliQ-vatten upp till 100 ml
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Lös MgCl 2 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 100 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.
OBS! MgCl 2 är mycket hygroskopiskt. Förvara inte öppnade flaskor under lång tid.

5 M NaCl (natriumklorid, volym: 1 l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
NaCl (58,44 g / mol) 292,2 g 5 M NaCl
MilliQ-vatten upp till 1L
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Lös upp NaCl i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 1 l. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

1 M NaOAc pH 4,7 (natriumacetat, volym: 100 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
NaOAc (82,03 g / mol) 0,8203 g 1 M NaOAc
MilliQ-vatten upp till 100 ml
Ättiksyra ger pH 4,7
DEPC 0,1 ml 0,1% DEPC

Lös NaOAc i vatten. Justera pH till 4,7. Anpassa sig till en slutlig volym på 100 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

0,2 M Na 2 CO 3 pH11.4 (natriumkarbonat, volym: 10 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Na 2 CO 3 0,21198 g 0,2 M Na 2 CO 3 pH = 11,4
MilliQ-vatten upp till 10 ml

Lös Na 2 CO 3 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 10 ml. PH-värdet bör vara 11,4.
OBS! Gör fräsch.

0,2 M NaHCO 3 pH8.2 (natriumbikarbonat, volym: 10 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
NaHCO 3 0,16802 g 0,2 M NaHCO 3: pH = 8,2
MilliQ-vatten upp till 10 ml

Lös NaHCO 3 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 10 ml. PH ska vara 8,2.
OBS! Gör fräsch.

1 M Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (volym 500 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O (177,99 g / mol) 88,995 g 1 M Na 2 HPO 4
MilliQ-vatten upp till 500 ml
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Lös Na 2 HPO 4 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 500 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

1 M NaH 2 PO 4 · H 2 O (volym 500 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
NaH 2 PO 4 · H 2 O (137,99 g / mol) 68,995 g 1 M NaH 2 PO 4
MilliQ-vatten upp till 500 ml
DEPC 0,5 ml 0,1% DEPC

Lös NaH 2 PO 4 i vatten, anpassa sig till en slutlig volym på 500 ml. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

5x NTE (total volym: 1l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
5 M NaCl 500 ml 2,5 M NaCl
1 M Tris-Cl pH 8 25 ml 50 mM Tris-Cl pH 8
0,5 M EDTA 5 ml 5 mM EDTA
MilliQ-vatten 470 ml slutliga volymen 1l

Blanda NaCl, Tris, EDTA och vatten. Inte DEPC-treat. Autoklav.

10 x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning), pH 7,0 (total volym: 1l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
5 M NaCl 260 ml 1,3 M NaCl
1 M Na 2 HPO 4 70 ml 70 mM Na 2 HPO 4
1 M NaH 2 PO 4 30 ml 30 mM NaH 2 PO 4
MilliQ-vatten 640 ml slutliga volymen 1l
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Blanda NaCl, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4 och vatten. Justera pH-värdet till 7,0 med HCl. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

20x SSC pH 7,0 (total volym: 1l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
NaCl (58,44 g / mol) 175,32 g 3 M NaCl
Na Citrate (294,1 g / mol) 88,23 g 0,300 M Na Citrate
MilliQ-vatten upp till 1 l
HCl ger pH 7,5
DEPC 1 ml 0,1% DEPC

Lös NaCl och Na-citrat i ~ 800 ml vatten. Justera pH-värdet till 7,0 med HCl. Justera volymen till 1 l med vatten. Tillsätt 0,1% DEPC. Lämna över natten. Autoklav.

5 x TBE (volym: 1l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Tris (121,14 g / mol) 54 g ~ 0,45 M Tris
Borsyra (61,83 g / mol) 27,5 g ~ 0,45 M borsyra
EDTA (372,24 g / mol) 3,7 g ~ 0,01 M EDTA
MilliQ-vatten upp till 1L

Blanda Tris, borsyra, EDTA och vatten. PH-värdet bör vara ~ 8,3. Späd till 1 x TBE före användning.

10 x TE pH 8,0 (Tris-EDTA, volym: 1l)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
1 M Tris-Cl, pH 8,0 100 ml 0,100 M Tris-Cl
0,5 M EDTA pH8.0 100 ml 0,050 M EDTA
MilliQ-vatten upp till 1L

Blanda Tris, EDTA och vatten. Inte DEPC-treat. Autoklav.
OBS! Tris ska inte DEPC behandlade! Använd RNas-fria pulver och späd med DEPC-treated/RNase-free MilliQ-vatten.

1 M Tris-HCl pH 7,5 till 9,5 (volym 500 ml)

Ingrediens volym / mängd slutlig koncentration
Tris (121,14 g / mol) 60,57 g 1 M Tris
MilliQ-vatten upp till 500 ml
HCl ger pH 7,5
HCl ger pH 8,0
NaOH ger pH 9,5

Lös Tris i DEPC-behandlat vatten. Justera till önskad pH. Anpassa sig till en slutlig volym på 500 ml. Autoklav.
OBS! Tris ska inte DEPC behandlade! Använd RNas-fria pulver och späd med DEPC-treated/RNase-free MilliQ-vatten.
OBS! I molekylär kloning (se ovan) finns en tabell som beskriver hur mycket koncentrera HCl behövs för att uppnå rätt pH.

MATERIAL OCH METODER

In situ-protokollet presenteras ovan och i filmen. Här ytterligare information om växtmaterial och prober som används i detta exempel beskrivs.

Växtmaterialet och experimentell design

Man kottar från Picea abies [L.] Karst. (Norge gran) samlades i Uppsala, Sverige, hösten 2007. Åtta koner var sektioneras och sektioner frånvarje kotte användes i varje behandling. Tre proteinas K koncentrationer testades, 1, 3 och 5 mikrogram / l och varje koncentration behandlades med eller utan RNas. Diabilder inte behandlas med RNas fanns kvar i PBS under RNas behandlingen. Arabidopsis thaliana [L.] Heynh. och Brassica napus L., odlades under kontrollerade förhållanden i en kultur kammare med 22 ° C/18 ° C dag / natt temperaturer och en fotoperiod på 16 timmar Unga blomställningar med blommor knoppar, steg från 00 till 10 (etapper enligt Smyth 5) studerades.

Crna sonder

Total RNA isolerades från P. Abies manliga koner som tidigare beskrivits 6 och från A. thaliana och B. napus med TRIzol (Gibco BRL, Frederick, Maryland, USA) och Qiagen RNeasy växt Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), respektive i enlighet med tillverkarens rekommendationer. Den cDNA syntetiserades från 0,5 till 1 RNA mikrogram totalt, beroende på art, med upphöjd III omvänt transkriptas (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) enligt tillverkarens anvisningar. AtAP3 och BnAP3 förnuft och fragment antisens och P. Abies känsla fragment var isolerade och förstärks med hjälp av gen specifika primers (tabell 1). DAL13 antisens fragment var isolerade och förstärkta med primer som i 7. En T7 överhäng inkom fragment från A. thaliana och P. Abies använda modifierad vända grundfärg bär på T7-sekvensen (tabell 1). Ett 500 bp-fragmentet var isolerat med BnAP3 specifika primers (tabell 1) och klonade in i en pGEM-T-vektor med en T7-promotor. För P. abies fragment alla PCR-reaktioner utfördes i en slutlig volym på 20 l med 0,2 U Phusion hög Fidility DNA-polymeras (Finnzymes, Esbo, Finland), 1x Phusion HF buffert, 200 mikroM varje dNTP, 0,3 mikroM av varje primer och 25-50 ng cDNA och en vanlig PCR-program användes med anlöpning temperatur 60-55 ° C (touch-down -1 ° C / cykel), följt av 55 ° C. Förnuft och antisens Crna sonder för alla tre arterna var syntetiseras in vitro transkription med DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7; Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) enligt tillverkarens rekommendationer och långa sonder var rötas till cirka 100-150 bp fragment med hjälp av ett Na 2 CO 3 buffert enligt 3.

RESULTAT

Här i resultatet avsnittet beskriver vi tre olika exempel på typiska resultat från in situ experiment.

Den genetiska mekanism som reglerar reproduktiv utveckling i gymnospermer och gömfröiga växter genom att ange manliga och kvinnliga organ identitet verkar vara evolutionära bevaras 7-9 trots att de två utsädet anläggningen linjerna separerade 285 miljoner år sedan 10. I A. thaliana den blommiga homeotic gener APETALA3 (AP3 11) och PISTILLATA (PI 12) är nödvändiga och tillräckliga för att ange manliga reproduktiva utveckling inom ramen för en blomma, och denna funktion verkar vara bevaras inom de gömfröiga växter härstamning 13. I gymnospermer som saknar blommor och har sina reproduktionsorgan ordnade i separata manliga och kvinnliga koner (Figur 1A-C), gener homolog till AP3 och PI är specifikt uttryckt i pollen bärande organen i mannens konen, den microsporophylls 7,14. Därför definierar en liknande uppsättning av homologa gener i både blomväxter och gymnospermer pollen-bärande organ.

Gene specifika prober mot AtAP3 och BnAP3 respektive gav signaler från steg 3 i unga blommig knoppar i en region som motsvarar whorl två och tre i A. thaliana och B. napus. I senare iscensatte knoppar signalerna var begränsade till att utveckla kronblad och ståndare (bild 2A och B). Dessa resultat överensstämmer med tidigare studier 11,15,16. Sonder riktad mot AP3 homolog i P. abies, DAL13, producerade signaler i microsporophylls av P. Abies manliga kottar både före och efter apikala meristem uppsägning (Fig. 2C och D), som väntat från tidigare studier 7,14. Sense prober gav ingen signal ovanstående bakgrund (Fig. 3A-B och data visas inte). Sammantaget ger dessa resultat visar uttryck av A. thaliana AP3 och dess Orthologs i B. napus och P. abies utveckla manliga könsorgan.

Figur 1. A.thaliana och B. napus blommor och pollen producera manliga kottarna av barrträd P. Abies Bilderna visar blomställningarna med blommiga knoppar och öppna blommor av A.thaliana och B.napuar i A och B respektive. Observera att gömfröiga växter blommor bortsett från den sterila hylle hamnar både manliga och kvinnliga könsorgan, ståndare och fruktblad. Visas i C är en kvist av gymnospermerna P. Abies med gröna vegetativa nålar och röda reproduktiva manliga kottar.

Figur 2. Redovisning av A. thaliana AP3 och homologa gener i B. napus och P. abies. Micrographs visa längdsnitt av A. thaliana och B. napus blomställningar i A respektive B och P. abies manliga kottar i C och D. Sektioner hybridiseras med antisens prober mot AtAP3 i A och BnAP3 i B visar signal i andra och tredje whorl blommig organ. Siffror visar blommig etapper enligt Smyth 5. Antisens prob riktad mot DAL13 genen gav signal i pollen bär microsporophylls av P. Abies manliga koner, som visas i CD. Exempel på microsporophylls indikeras med pilar. Pilspetsar i AD pekar på hybridisering signal, som förefaller som lila. I C-och D fenolföreningar ge brunaktig ospecifikt färg till enskilda celler i det centrala märg. s, foderblad, p, kronblad, st, ståndare, c, pistill, ms, microsporophyll, pi, märg, PP, före pollen celler. Bar: 100 ìm.

Figur 3. DAL13 uttryck i manligt kottar från P. abies. Alla micrographs (AH), visar längdsnitt av manliga koner efter apikala meristem uppsägning. Pilspetsar peka på celltyper som DAL13 uttrycks. Sektioner i A och B är hybridiseras med en känsla kontroll sond för att avgöra bakgrundsfärgning. Micrographs C till H hybridiseras med en DAL13 antisens sond. Avsnitten från experiment med och utan RNas behandling visas i D, F, H och C, E, G respektive. Micrographs från försök med 1 mikrogram / ml proteinas K visas i C och D, 3 mikrogram / ml i E och F, och 5 mikrogram / ml i G och H. Bar: 100 ìm.

Discussion

Två aspekter av P. Abies protokoll har optimerats i förhållande till A. thaliana / B. napus protokoll, RNase behandling och proteinas K koncentration. Den RNas bort bakgrunden signaler och därmed ökar 17 signalen specificitet. Det proteinas K behandlingen är nödvändig för att permeabilize vävnaderna så att proben kan gå in och hybridisera med RNA-pool av intresse. Den DAL13 antisens sonden gav en högre signal utan RNase-behandling (Fig. 3C, E, G) jämfört med sektioner som behandlats med RNas i 30 min (Figur 2D, F och H). Eftersom RNas-behandling inte förbättrar signalen den togs bort från protokollet. Det proteinas K behandlingen testades vid tre olika koncentrationer, 1, 3 och 5 mikrogram / ml. I fallet P. Abies en låg eller ingen signal observerades med 1 mikrogram / ​​ml proteinas K (Fig. 3C-D). En stark signal erhölls med både 3 mikrogram / ml (Fig. 3E-F) och 5 mikrogram / ml Eftersom ingen märkbar skillnad i signalstyrka (bild 3G-H) proteinas K. hittades vid användning 5 mikrogram / ml proteinas K jämfört med 3 mikrogram / ml, valde vi att använda 3 mikrogram / ml i vårt protokoll. Det är troligt att behovet av en högre proteinas K koncentration i P. Abies manliga kottar jämfört med A. thaliana och B. napus blommiga knoppar beror på att mer kompakt vävnad med högre halter av fenoler och polysackarider.

Under fixering och inbäddning vissa skillnader mellan A. thaliana / B. napus protokoll och P. Abies-protokollet är uppenbara. Vävnaden av intresse fast att RNA lagring och detta är ett kritiskt steg, eftersom dåligt fast material kan ge en låg eller icke detekterbar signal även om mRNA är mycket riklig. Vävnaden är uttorkade, rensas och inbäddade i vax i gradvisa förändringar för att undvika vävnadsskada, och i vissa protokoll 0,85% NaCl läggs till etanol i uttorkning för att ytterligare undvika krympning och svullnad i cellerna 3. Den uttorkning steget under inbäddning kan utföras på is för att hålla RNas aktivitet på minimum. I P. abies protokollet 4% paraformaldehyd fixa lösning innehåller 0,25% glutaraldehyd, som är tänkt att ge en bättre RNA behålla 17 trots att vissa hävdar att det förmodligen göra någon skillnad 3. Efter sektionering materialet är fast på diabilder och förbehandlade (dvs avvaxade, uppblött, permeabilized, behandlas för att minska icke-specifik bindning av sonden och slutligen uttorkad) innan hybridisering.

I protokollet presenteras här hela upptäckt kan utföras i vanliga laboratorier, utvecklar signalen oftast inom 1-3 dagar och förhållandet mellan signalen över bakgrunden kan kontinuerligt följas upp. I DIG-märkta prober brukar ge en tydligare signal jämfört med radioaktivt märkta prober, är mer stabila och kan återanvändas i rad experiment. Å andra sidan är känsligheten reduceras jämfört med radioaktiva sonder 17. In situ hybridisering upptäcker uttryck med hjälp av en märkt sond specifika för en viss mRNA. Radio-märkning är en robust och känslig märkning metoden men det kräver hantering av radioaktivitet och det tar flera veckor innan resultaten kan upptäckas. Antigen-märkta prober, å andra sidan, är mer stabila, mindre farliga och kräver exponering för att upptäcka medium för ett par dagar endast 17. Således är antigen-märkningssystem som dominerar för närvarande. Det mest kritiska steget oavsett protokoll är sonden design. Försiktighet bör vidtas för att kontrollera att proben har en hög specificitet och är märkt med hög kvalitet UTPs. Ibland hybridisering temperatur och / eller reaktion längd måste anpassas för specifika sonder.

Vår nya protokollet bygger på DIG-märkta prober kommer att underlätta lokalisering av mRNA uttryck samtidigt arter allt från A. thaliana till P. abies, och bör med smärre justeringar kunna användas i andra växtarter. Protokollet har förutom manliga koner, har också testats på olika stadier av vegetativa skott och både zygotic och somatiska embryon från P. Abies med goda resultat (opublicerade resultat;. Karlgren et al).

Disclosures

Författarna har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Vi är mycket tacksamma mot Anders Bovin som tillhandahöll musik för vår film och till Michael Elliot Bestånd för volontärarbete vara speakerröst. Stöd kom från Carl Tryggers stiftelse, det strategiska forskningsprogrammet jordbruket funktionsgenomik (AgriFunGen) vid Svenska lantbruksuniversitet, Svenska Vetenskapsrådet (VR) och Svenska Forskningsrådet för miljö, areella näringar och samhällsbyggande (FORMAS ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride Sigma-Aldrich A6404-200ml minimum 98%
Acrylamide, linear Ambion 9520
Anti-DIG-antibodies Roche Group
Blocking reagent Roche Group 11 175 041 910 or 11 096 176 001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-50g minimum 98%
Deionized formamide Sigma-Aldrich
Denhardts solution Sigma-Aldrich D2532-5ml
DEPC, diethylpyrocarbonate Sigma-Aldrich
Dextran sulfate Sigma-Aldrich
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Roche Group 11175025910
Glutaraldehyde (25%) Histolab
Glycogen Ambion 9510G
Histoclear II Histolab You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Histowax Histolab Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500g
Paraplast plus Sigma-Aldrich P3683-1kg Histowax or Paraplast can be used for embedding.
Phusion™ High-Fidility DNA Polymerase Finnzymes
Probe-on Plus slides Fisher Scientific 22-230-900
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5mg
RNase A Sigma-Aldrich R5503-100mg
Tissue-clear Sakura Finetek You may use Tissue-clear, Histoclear II, xylen or something similar when embedding your tissue.
Triethanolamine Sigma-Aldrich T1377-100ml minimum 98%
Triton X-100 use your standard product in the lab Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
tRNA Sigma-Aldrich 83853-100mg
Tween-20 use your standard product in the lab Use one or both of Triton X-100 and Tween-20.
Western Blue Promega Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carr, S. M., Irish, V. F. Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica. Planta. 201 (2), 179-188 (1997).
  2. Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).
  3. Jackson, D. In situ hybridization in plants. Molecular Plant Patology: a practical approach. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. , University Press. Oxford. (1991).
  4. Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. In situ hybridization: a practical guide. , BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).
  5. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  6. Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees. Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).
  7. Sundstrom, J., et al. MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms. Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).
  8. Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms. Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).
  9. Winter, K. U., et al. MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).
  10. Savard, L., et al. Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).
  11. Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell. 68 (4), 683-697 (1992).
  12. Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. Genes directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).
  13. Kramer, E. M., Irish, V. F. Evolution of genetic mechanisms controlling petal development. Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).
  14. Sundstrom, J., Engstrom, P. Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia. Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).
  15. Carlsson, J., et al. Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers. Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).
  16. Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus. Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).
  17. Ying, S., Kay, A. B. The technique of in situ hybridization. Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).

Tags

Växtbiologi RNA uttrycks-analyser Norge gran Arabidopsis raps barrträd
Icke-radioaktivt<em> På plats</em> Hybridisering protokollet som gäller för Norge gran och en rad arter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karlgren, A., Carlsson, J.,… More

Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), e1205, doi:10.3791/1205 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter