Summary
성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피는 성인 척추 동물의 머리 세포 재생의 메커니즘을 이해하는 좋은 모델 시스템이다. 이 프로토콜은 우리가 휴대 전화와 subcellular 수준에서 재생 이벤트를 공부에 대한 조직 샘플을 얻을 수를 통해 상피 조직의 미세 절개를 보여줍니다.
Abstract
내이 (内耳)에 Neurosensory 상피 조직은 청력과 균형 기능에 중요한 구조입니다. 따라서, 그것은 주로 세포의 두 가지 유형으로 구성되어있는 상피 조직의 세포 및 분자 기능을 이해하는 것이 중요합니다 : 세포 (HCs) 및 지원 전지 (SCS). 여기서 우리는 상피 구조가 고도로 공부 모든 척추 동물에 보존되어 있기 때문에 성인 zebrafish뿐만 아니라에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직을 연구하기 위해 선택할뿐만 아니라 성인 zebrafish는 HCs, 포유류는 출생 직후에 잃게하는 능력을 재생 할 수 있기 때문에. 우리는 HC 손실의 결과로 인간 심리 / 균형 적자의 임상 치료를 위해 도움이 될 수있는 성인 척추 동물의 내이 (内耳) HC 재생의 메커니즘을 연구하기위한 모델 시스템으로 성인 zebrafish의 내이 (内耳)를 사용합니다.
여기 우리는 성인 zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총 훌륭한 해부를하는 방법을 보여줍니다. 총 해부는 내이 (内耳)를 둘러싼 조직을 제거하고 우리가 감각 상피 조직의 세부 구조를 검사할 수있는 조직 섹션을 준비하는 데 도움이됩니다. 미세 절개은 개별 상피의 비 - 감각 상피 조직을 깨끗이 치우고 전체 마운트 상피 샘플에서 쉽게 전체 상피의 이질을 검토하는 데 있습니다.
Protocol
1 부 : 조직의 준비
- 와 성인 zebrafish를 안락사 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금, 0.03 %) MS - 222 버퍼.
- 물고기 목을 벨. 아래턱을 잘라 최대 복부 측면과 해부 패드에 머리를 장소, 곤충 핀으로 조직을 고정. 두개골에 복부 부드러운 조직을 제거하고 해부 현미경 하에서 미세 핀셋 한 쌍의와 두개골 캡슐의 복부 부분을 깨서.
- 4 ° C 하룻밤에 paraformaldehyde에서 생선 머리 (4 %) 이후의 수정 프로그램입니다.
- 3 번 5 분 때마다 (인산은 1X, 살린 버퍼) PBS에 고정 생선 머리를 씻어.
2 부 : 내이 (内耳)의 총 해부
- 복부 측면까지 함께 해부 패드에 생선 머리를 놓습니다. 곤충 핀으로 고정. 모든 다음 단계는 해부 현미경 하에서 실시하고 있습니다.
- 고급 핀셋 한 켤레와 내이 (内耳)를 통해 두개골 뼈를 제거하고 다음 조심스럽게 내이 (内耳)의 조직을 당겨 : saccules, lagenae 및 utricles 있습니다. saccule과 lagena가 긴밀하게 함께 서로 부착 때문에 철수하는 동안 utricle (saccule 및 lagena에 앞쪽에), 해부하는 동안 다른 쪽 끝을 기관에서 분리하는 것입니다 매우 높다.
- PBS (1X)에서 내이 (内耳)의 조직 놔. 더 이상의 미세 절개가 필요하지 않은 경우, PBS (1X)과 조직에게 2-3 번 씻어하고는 다른 실험 예 cryosections 사용할 수 있습니다.
파트 3 : 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 훌륭한 해부
- 미세 절개는 깨끗한 유리 슬라이드에 PBS (1X)의 드롭 수행하실 수 있습니다.
- 고급 핀셋 두 쌍이있는 utricle에서 utricular otolith를 제거하고, 원하는 경우, 벌금 족집게 한 켤레와 바늘 블레이드와 상피 조직에서가 아닌 감각 상피 조직과 innervation을 잘라.
- 가능한 한 그대로 전체 saccule을 유지하려고하면서 saccular 및 lagenar 상피 조직을 분리하기 전에 lagenar otolith를 제거합니다. 복부 측면까지 함께 PBS 드롭의 조직을 놓으십시오. 조심스럽게 saccule과 lagena 사이에 잘라 바늘 블레이드를 사용합니다. 원하는 경우, 과도한 아닌 감각 상피 조직 및 고급 핀셋과 바늘 블레이드와 innvervation를 낸다.
파트 4 : 감각 상피 조직에있는 세포의 형광 염색법
- 3 회, 5 분 때마다 PBT (1XPBS, 1 % 트리톤 X - 100)와 감각 상피 조직을 씻어.
- 로 상피 조직을 품어 fluophore - 라벨 phalloidin (예 : 알렉사 플라워 488 Phalloidin, 1:1,000 희석) 실온에서 30 분.
- 3 회, 10 분 때마다 PBT와 감각 상피 조직을 씻어.
- 미디어를 장착과 함께 슬라이드에 상피 조직을 탑재하고 적절한 파장의 필터를 형광 현미경으로 스테인드 조직을 확인하십시오.
- 성공적인 해부와 얼룩 후, 강력한 헤어 셀 번들 얼룩과 함께 그대로 상피 조직은 현미경 (그림 1) 아래에서 볼 수 있습니다.
그림 1. saccular 감각 상피의 세포는 알렉사 밀가루 488 Phalloidin (녹색) 물들일되었습니다. 조직 샘플은 종이에 언급으로 해부와 스테인드되었습니다. 몇몇 사진은 샘플의 다른 위치에서 찍은 및 어도비 포토샵 7.0과 함께 기와되었습니다.
스케일 바 = 150μm.
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Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 감각 상피 조직의 세포와 subcellular 기능을 공부에 대한 조직 샘플을 준비하는 수 성인 zebrafish의 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 매출과 미세 절개를 설명했다.
성공적인 해부, 매우 첫 번째 단계, 고정을 수행하기 위해서는 매우 중요합니다. 이전 솔루션은 절개 중에 처리하기 어려운 조직의 밑에 - 고정의 결과 때문에 항상 신선한 paraformaldehyde 솔루션을 사용할 수 있는지 확인합니다. 그러나, 그것은 절개 후 면역 / histological 얼룩의 결과에 영향을 것이기 때문에 당신이 너무 오래를위한 고정 솔루션에서 그들을 떠날하여 조직을 통해 - 수정하지 않은지 확인하십시오. 또한, 적절한 크기에 잘 유지 해부 도구를 사용하면 특히 미세 해부에 대한, 물론 중요합니다.
이 총 해부 프로토콜은 또한 조직을 특정 DNAs / RNAS / 단백질의 추출에 대한 내이 (内耳)의 조직을 취득 적용할 수 있습니다. 이 경우에는 절개가 바로 paraformaldehyde 고정하지 않고 물고기의 희생 이후에 실시해야합니다. 또한, 특정 일상적인 방법은 대상 macromolecules의 저하를 보호하는 데 사용할 수 있습니다. 조직 특정 RNA 추출에 대한 해부 동안 예를 들어, 생선 머리 (낮은 턱 제거)을 씻어서 수 있으며 다음 RNAlater 솔루션 (앰비온)에 열중.
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Acknowledgments
이 연구는 국가 인간 게놈 연구소, 건강의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Reagent | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) | Reagent | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Dissection microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| Insect pins | Tool | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Tweezers | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| Needle blade | Tool | Sharpoint | 78-6810 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| Dissection pad | Tool | eNasco | SB07840M | |
| Zebrafish | Animal | Various | n/a |
