Summary
האפיתל באוזן הפנימית החושית של דג הזברה מבוגר היא מערכת מודל טוב להבנת מנגנוני התחדשות התאים שיער חוליות מבוגר. פרוטוקול זה מדגים את לנתיחה קנס של האפיטל, שבאמצעותו אנו יכולים לקבל דגימות רקמה לחקר אירועי משובי ברמות הסלולר subcellular.
Abstract
נוירו epithelia באוזן הפנימית הם מבנים חיוני פונקציות השמיעה ושיווי המשקל. לכן, חשוב להבין את התכונות תאית ומולקולרית של האפיטל, אשר מורכב בעיקר שני סוגים של תאים: תאים שיער (HCS) ותאים תומכים (SCS). כאן אנו בוחרים ללמוד את epithelia האוזן הפנימית חושית דג הזברה מבוגר לא רק בגלל המבנים אפיתל הם שמור ביותר בכל חוליות למד, אלא גם משום דג הזברה מבוגר הוא מסוגל להתחדש HCS, יכולת כי היונקים לאבד זמן קצר לאחר הלידה. אנו משתמשים האוזן הפנימית של דג הזברה בוגר כמודל למערכת ללמוד את מנגנוני התחדשות פנימית HC אוזניים אצל בעלי החוליות מבוגר שיכול להיות מועיל עבור הטיפול הקליני של שמיעה / איזון גירעונות האדם כתוצאה של אובדן HC.
כאן אנו מדגימים איך לעשות והניתוחים הגולמי קנס של epithelia האוזן הפנימית חושית דג הזברה מבוגר. דיסקציה ברוטו מסיר את הרקמות הסובבות את האוזן הפנימית מועיל להכנת סעיפים רקמות, אשר מאפשר לנו לבחון את המבנה המפורט של epithelia החושי. דיסקציה בסדר שמנקה את אי - חושית, רקמות אפיתל של האפיתל בנפרד ומאפשר לנו לבחון את ההטרוגניות של האפיתל כל בקלות כל הר דגימות אפיתל.
Protocol
חלק 1: הכנת הרקמה
- להרדים את דג הזברה מבוגר עם שנאגרו MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate מלח methanesulfonate, 0.03%).
- לערוף את הדגים. חותכים את הלסת התחתונה, במקום הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני למעלה, לשתק את הרקמה עם סיכות חרקים. הסר את רקמות רכות הגחוני אל הגולגולת לפצח את החלק הגחוני של הקפסולה את הגולגולת עם פינצטה קנס תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- תקן ראש דג paraformaldehyde (4%) ב -4 ° C במשך הלילה.
- שטפו את ראש הדג קבוע PBS (פוספט בופר, 1X) במשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
חלק 2: דיסקציה הגולמי של האוזן הפנימית
- מניחים את הראש על כרית דגים לנתיחה עם למעלה בצד הגחון. לשתק אותו עם סיכות חרקים. כל הצעדים הבאים מתבצעים תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
- עם פינצטה בסדר, להסיר את עצם הגולגולת מעל האוזן הפנימית ואז בזהירות לשלוף את רקמות האוזן הפנימית: saccules, lagenae ו utricles. שקיק ו lagena הם בחוזקה לצרף אחד את השני ובכך להוציא ביחד בעוד utricle (anterior את שקיק ו lagena), סביר מאוד להיות מנותקת מן האיברים הקצה השני במהלך לנתיחה.
- שים את רקמות האוזן הפנימית של PBS (1X). אם לא לנתיחה קנס נוסף נדרש, יש לשטוף את הרקמה 2-3 פעמים עם PBS (1X) והוא יכול לשמש בניסויים אחרים, למשל cryosections.
חלק 3: דיסקציה פיין epithelia של האוזן הפנימית החושית
- דיסקציה הקנס יכול להתבצע ירידה של PBS (1X) בשקופית זכוכית נקי.
- הסר את אבן האוזן utricular מ utricle עם שני זוגות של פינצטה בסדר, ואם תרצה, לקצץ את רקמת האפיתל ללא חושית ועל עצבוב מן epithelia עם פינצטה בסדר להב מחט.
- הסר את אבן האוזן lagenar לפני הפרדת saccular ו lagenar epithelia בעוד מנסה לשמור על שקיק כולו שלם ככל האפשר. מניחים את הרקמה הירידה PBS עם למעלה בצד הגחון. השתמש בלהב המחט בזהירות לחתוך בין שקיק ו lagena. חתוך את הרקמה מופרז שאינו חושי אפיתל innvervation עם פינצטה בסדר הלהב מחט, אם תרצה בכך.
חלק 4: מכתים פלורסנט של תאים שיער epithelia חושית
- שוטפים את חושי epithelia עם PBT (1XPBS ואת טריטון 1% X-100) במשך 3 פעמים, 5 דקות בכל פעם.
- דגירה epithelia עם fluophore שכותרתו phalloidin (למשל אלקסה 488 Phalloidin קמח, 1:1,000 דילול) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את חושי epithelia עם PBT במשך 3 פעמים, 10 דקות בכל פעם.
- הר epithelia לשקופית עם הרכבה בינונית לבדוק את הרקמה תחת המיקרוסקופ מוכתם ניאון עם מסננים של הגל הנכון.
- לאחר דיסקציה מכתים מוצלח, epithelia שלם עם תא חזקה מכתים שיער צרור ניתן לראות תחת מיקרוסקופ (איור 1).
באיור 1. תאים שיער של האפיתל חושית saccular הוכתמו אלקסה 488 קמח Phalloidin (ירוק). דגימת הרקמה היה גזור ומוכתמת כאמור בעיתון. מספר תמונות צולמו בתנוחות שונות המדגם רעפים יחד עם Adobe Photoshop 7.0.
בר סולם = 150μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו תיאר את לנתיחה הגולמי קנס של epithelia האוזן הפנימית החושית של דג הזברה למבוגרים, אשר מאפשר לנו להכין דגימה לחקר תכונות הסלולר subcellular של epithelia החושי.
על מנת לבצע דיסקציה מוצלח, הצעד הראשון מאוד, קיבעון, הוא מאוד חשוב. ודא כי אתה תמיד להשתמש בפתרון paraformaldehyde מוכן טרי כי הפתרון הישן תגרום קיבעון תחת של רקמות שקשה לטפל במהלך הניתוח. עם זאת, ודא כי אתה לא מעל לתקן את הרקמות על ידי השארת אותם בפתרון קיבעון זמן רב מדי, כי זה יפריע את תוצאות מכתים החיסון / היסטולוגית לאחר הניתוח. בנוסף, באמצעות מתוחזק היטב בכלים לנתיחה, כי הם בגדלים המתאימים הוא קריטי גם כן, במיוחד עבור לנתיחה את הקנס.
פרוטוקול זה לנתיחה ברוטו יכול גם להיות מותאם להשגת רקמות האוזן הפנימית להפקת רקמות ספציפיות DNAs / RNAs / חלבונים. במקרה זה, ביתור אמור להתבצע מיד לאחר הקרבת הדגים ללא קיבוע paraformaldehyde. בנוסף, שיטות שגרתיות מסוימות יכול לשמש כדי להגן על ההשפלה של מקרומולקולות היעד. לדוגמה, ראש דג (הלסת התחתונה מוסר) יכול להיות שטופים אז שקוע בפתרון RNAlater (Ambion) במהלך לנתיחה על רקמות ספציפיות מיצוי RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית הלאומי לחקר הגנום האנושי, המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Reagent | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X) | Reagent | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Dissection microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| Insect pins | Tool | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| Tweezers | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| Needle blade | Tool | Sharpoint | 78-6810 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| Dissection pad | Tool | eNasco | SB07840M | |
| Zebrafish | Animal | Various | n/a |
