Grove en fijne Dissectie van binnenoor Sensory epitheel in Adult zebravis ( Danio rerio)

Summary

Het binnenoor sensorische epitheel van volwassen zebravis is een goed model voor het begrijpen van de mechanismen van haar cel regeneratie in volwassen gewervelde dieren. Dit protocol laat de fijne ontleding van het epitheel, waardoor we kunnen weefselmonsters krijgen voor het bestuderen van de regeneratieve gebeurtenissen in cellulaire en subcellulaire niveau.

Abstract

Neurosensorische epitheel in het binnenoor zijn de cruciale structuren voor gehoor en evenwicht functies. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire kenmerken van het epitheel, die hoofdzakelijk zijn samengesteld uit twee soorten cellen: haarcellen (HCS) en het ondersteunen van cellen (SC). Hier kiezen we ervoor om het binnenoor sensorische epitheel bij volwassen zebravissen niet alleen studeren, omdat de epitheliale structuren zijn sterk geconserveerd in de bestudeerde alle gewervelde dieren, maar ook omdat de volwassen zebravis is in staat om HC, een vermogen dat zoogdieren te verliezen kort na de geboorte te regenereren. We maken gebruik van het binnenoor van volwassen zebravis als model systeem om de mechanismen van binnenoor HC regeneratie studie bij volwassen gewervelde dieren die nuttig zouden kunnen zijn voor de klinische behandeling van het gehoor / balans tekorten in de menselijke als gevolg van de HC verlies.

Hier laten we zien hoe de grove en fijne dissecties van binnenoor sensorische epitheel bij volwassen zebravissen doen. De bruto dissectie verwijdert de weefsels rondom het binnenoor en is nuttig voor het bereiden van weefselcoupes, die ons in staat stelt te onderzoeken of het gedetailleerde structuur van de sensorische epitheel. De fijne dissectie ruimt de niet-zintuiglijke-epitheliale weefsels van elke individuele epitheel en stelt ons in staat om de heterogeniteit van de gehele epitheel gemakkelijk te onderzoeken in zijn geheel-mount epitheliale monsters.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van het weefsel

1. Euthanaseren de volwassen zebravissen met gebufferde MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout, 0,03%).
2. Onthoofden van de vis. Snijd de onderkaak, plaats het hoofd op de dissectie pad met de ventrale kant naar boven, en immobiliseren het weefsel met een insect pinnen. Verwijder het zachte weefsel ventrale aan de schedel en crack opent het ventrale deel van de schedel capsule met een paar fijne pincet onder een dissectie microscoop.
3. Zet de vis kop in paraformaldehyd (4%) bij 4 ° C gedurende de nacht.
4. Spoel de vaste vis kop in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1X) voor de 3 keer, 5 minuten per keer.

Deel 2: Bruto dissectie van het binnenoor

1. Leg de vis hoofd op de dissectie pad met de ventrale zijde naar boven. Immobiliseren het met insect pinnen. Alle volgende stappen worden uitgevoerd in het kader van de dissectie microscoop.
2. Met een paar fijne pincet, verwijder het schedelbot over het binnenoor en daarna voorzichtig trek het binnenoor weefsels: saccules, lagenae, en utricles. De saccule en lagena zijn nauw aan elkaar vast en zo trek bij elkaar, terwijl de utricle (anterior aan de saccule en lagena), zal zeer waarschijnlijk worden losgemaakt van de andere kant organen tijdens dissectie.
3. Leg het binnenoor weefsels in PBS (1X). Indien geen nadere fijne dissectie nodig is, spoelt het weefsel 2-3 keer met PBS (1X) en het kan gebruikt worden voor andere experimenten, bijvoorbeeld vriescoupes.

Deel 3: Fijn dissectie van het binnenoor zintuiglijke epithelia

1. De boete dissectie kan worden uitgevoerd in een daling van PBS (1X) op een schoon glasplaatje.
2. Haal de utricular otoliet van de utricle met twee paar fijne pincet, en, indien gewenst, trim off van de niet-zintuiglijke epitheelweefsel en de innervatie van het epitheel met een paar fijne pincet en een naald mes.
3. Verwijder de lagenar otoliet voordat scheiden zakvormig en lagenar epitheel, terwijl proberen om het hele saccule zo intact mogelijk te houden. Plaats het weefsel in de PBS druppel met ventrale zijde naar boven. Gebruik de naald mes zorgvuldig te snijden tussen de saccule en lagena. Snij de excessieve niet-zintuiglijke epitheelweefsel en de innvervation met fijne pincet en de naald blad, indien gewenst.

Deel 4: Fluorescerende kleuring van de haarcellen in de sensorische epithelia

1. Spoel de sensorische epitheel met PBT (1XPBS en 1% Triton X-100) voor de 3 keer, 5 min per keer.
2. Incubeer het epitheel met fluophore-gelabeld phalloidin (bv. Alexa Meel 488 Phalloidin, 1:1000 verdunning) gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
3. Spoel de sensorische epitheel met PBT voor drie keer, tien minuten per keer.
4. Monteer het epitheel op een dia met montage medium en controleer de gekleurde weefsel onder de fluorescentie microscoop met filters van de juiste golflengte.
5. Na de succesvolle dissectie en kleuring, kunnen intacte epitheel met een sterke haarcel bundel verkleuring te zien onder de microscoop (afb. 1).

Figuur 1. Haarcellen van het zakvormig sensorische epitheel werden gekleurd met Alexa Flour 488 Phalloidin (groen). Het weefselmonster was ontleed en gekleurd zoals vermeld in de krant. Verschillende foto's werden genomen op verschillende posities van het monster en betegelde samen met Adobe Photoshop 7.0.
Schaalbalk = 150μm.

Discussion

In dit protocol beschrijven we de grove en fijne ontleding van het binnenoor sensorische epitheel van volwassen zebravissen, die ons in staat stelt weefselmonster voor te bereiden op het bestuderen van de cellulaire en subcellulaire kenmerken van de sensorische epitheel.

Met het oog op het uitvoeren van een succesvolle dissectie, de allereerste stap, fixatie, is erg belangrijk. Zorg ervoor dat u altijd vers bereide paraformaldehyde oplossing te gebruiken omdat oude oplossing zal resulteren in minder-fixatie van de weefsels die zijn moeilijk te hanteren tijdens de dissectie. Zorg echter wel dat je niet de weefsels over-fix door ze op de vastlegging oplossing te lang, want het zal interfereren met de resultaten van het immuunsysteem / histologische kleuring na de dissectie. Daarnaast, met behulp van goed onderhouden dissectie-instrumenten die in passende maten is van cruciaal belang als goed, vooral voor de fijne dissectie.

Deze bruto dissectie protocol kan ook worden aangepast voor het verwerven van innerlijke oor weefsels voor de winning van weefsel-specifieke DNA / RNA / eiwitten. In dat geval moet de dissectie worden uitgevoerd direct na het offer van de vis zonder paraformaldehyde fixatie. Daarnaast kunnen bepaalde routine-methoden worden gebruikt om de afbraak van het doel macromoleculen te beschermen. Bijvoorbeeld, kan de vis kop (lagere kaak verwijderd) worden gespoeld en vervolgens ondergedompeld in de RNAlater oplossing (Ambion) tijdens de dissectie van weefsel-specifieke RNA-extractie.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	Various	n/a