La disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en adultos de pez cebra ( Danio rerio)

Summary

El epitelio sensorial del oído interno de los adultos de pez cebra es un buen modelo de sistema para la comprensión de los mecanismos de regeneración de las células ciliadas en los vertebrados adultos. Este protocolo demuestra la disección fina de los epitelios, a través del cual podemos obtener muestras de tejido para el estudio de los eventos de regeneración a nivel celular y subcelular.

Abstract

Neurosensorial epitelio del oído interno son las estructuras esenciales para las funciones de audición y el equilibrio. Por lo tanto, es importante entender las características celulares y moleculares de los epitelios, que se componen principalmente de dos tipos de células: las células ciliadas (HC) y células de soporte (SC). Aquí elegimos para el estudio de los epitelios sensoriales del oído interno en el pez cebra adulto, no sólo porque las estructuras epiteliales son altamente conservadas en todos los vertebrados estudiados, sino también porque los adultos de pez cebra es capaz de regenerar los HC, una habilidad que los mamíferos pierden poco después del nacimiento. Nosotros usamos el oído interno de adultos de pez cebra como sistema modelo para estudiar los mecanismos de regeneración del oído interno HC en los vertebrados adultos que podrían ser útiles para el tratamiento clínico de la deficiencia auditiva / equilibrio en humanos como resultado de la pérdida de HC.

Aquí se demuestra cómo hacer la disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno en el pez cebra adulto. La disección bruto elimina los tejidos que rodean el oído interno y es de gran ayuda para la preparación de las secciones de tejido, lo que nos permite examinar la estructura detallada de los epitelios sensoriales. La disección fina limpia los tejidos no-sensorial-epitelial del epitelio cada individuo y nos permite examinar la heterogeneidad del epitelio toda facilidad en todo el montaje de muestras epiteliales.

Protocol

Parte 1: Preparación del tejido

1. La eutanasia de los adultos de pez cebra con buffer MS-222 (el 3-aminobenzoato de sal metanosulfonato, 0,03%).
2. Decapitar a los peces. Cortar la mandíbula inferior, colocar la cabeza en el cojín de disección con la cara ventral hacia arriba, e inmovilizar el tejido con alfileres de insectos. Eliminar los tejidos blandos en el cráneo ventral y el crack abrir la parte ventral de la cápsula del cráneo con un par de pinzas finas bajo el microscopio de disección.
3. Fijar la cabeza de pescado en paraformaldehído (4%) a 4 ° C durante la noche.
4. Enjuague la cabeza de pescado fija en PBS (tampón fosfato salino, 1X) por 3 veces, 5 minutos cada vez.

Parte 2: la disección macroscópica del oído interno

1. Coloque la cabeza de pescado en la plataforma de la disección con el lado ventral. Inmovilizar con alfileres de insectos. Todos estos pasos se llevan a cabo bajo el microscopio de disección.
2. Con un par de pinzas finas, eliminar el hueso del cráneo en el oído interno y a continuación, extraiga los tejidos del oído interno: sáculos, lagenae y utrículos. El sáculo y lagena están estrechamente unirse unas a otras y por lo tanto salir juntos, mientras que el utrículo (anterior a la sáculo y lagena), muy probablemente se va a separar de los órganos otro extremo durante la disección.
3. Ponga los tejidos del oído interno en PBS (1X). Si no hay disección fina se necesitan más, enjuague el tejido 2-3 veces con PBS (1X) y que puede ser utilizado para otros experimentos, cryosections por ejemplo.

Parte 3: la disección fina de los epitelios sensoriales del oído interno

1. La disección fina se puede realizar en una gota de PBS (1X) en un portaobjetos de vidrio limpio.
2. Quitar el otolito utricular del utrículo con dos pares de pinzas finas, y, si lo desea, recorte del tejido epitelial no-sensorial y la inervación de los epitelios de la con un par de pinzas finas y una hoja de aguja.
3. Quitar el otolito sacular lagenar antes de la separación y el epitelio lagenar mientras tratan de mantener el sáculo todo lo más intacta posible. Coloque el tejido en la caída de PBS con un máximo de la parte ventral. Use la hoja de aguja para cortar cuidadosamente entre el sáculo y lagena. Se quita el exceso de no-sensorial tejido epitelial y el innvervation con pinzas finas y la hoja de aguja, si lo desea.

Parte 4: tinción fluorescente de las células ciliadas del epitelio sensorial

1. Enjuague los epitelios sensoriales con PBT (1XPBS y 1% de Triton X-100) por 3 veces, 5 minutos cada vez.
2. Incubar los epitelios con fluophore marcado con phalloidin (por ejemplo, harina de Alexa 488 faloidina, 1:1000 dilución) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Enjuague los epitelios sensoriales con PBT de 3 veces, 10 minutos cada vez.
4. Monte de los epitelios en un portaobjetos con medio de montaje y comprobar que el tejido teñido bajo el microscopio de fluorescencia con filtros de longitud de onda adecuada.
5. Después de la disección con éxito y las manchas, el epitelio intacto, con manchas paquete fuerte de las células ciliadas se puede ver bajo el microscopio (Fig. 1).

Figura 1. Las células ciliadas del epitelio sensorial sacular se tiñeron con Alexa Harina 488 faloidina (verde). La muestra de tejido se disecó y se tiñeron como se menciona en el documento. Varias fotos fueron tomadas en diferentes posiciones de la muestra y azulejos, junto con Adobe Photoshop 7.0.
Barra de escala = 150μm.

Discussion

En este protocolo, que describe la disección fina y gruesa de los epitelios sensoriales del oído interno del pez cebra adulto, que nos permite preparar muestras de tejidos para estudiar las características celulares y subcelulares de los epitelios sensoriales.

Con el fin de llevar a cabo una disección de éxito, el primer paso, la fijación, es muy importante. Asegúrese de usar siempre solución de paraformaldehído al recién preparada porque la solución de edad se traducirá en menores de fijación de los tejidos que son difíciles de manejar durante la disección. Sin embargo, asegúrese de que no sobre-corregir los tejidos, dejando en la solución de fijación durante demasiado tiempo, porque va a interferir con los resultados de la tinción inmune / histológicas después de la disección. Además, el uso en buen estado las herramientas de disección que se encuentran en los tamaños adecuados es crítica y, sobre todo para la disección fina.

Este protocolo de disección bruto también puede ser adaptado para la adquisición de los tejidos del oído interno para la extracción de tejidos específicos ADN / ARN / proteínas. En ese caso, la disección debe llevarse a cabo inmediatamente después del sacrificio de los peces sin fijación de paraformaldehído. Además, algunos métodos de rutina puede ser utilizado para proteger de la degradación de las macromoléculas de destino. Por ejemplo, la cabeza de pescado (mandíbula inferior a eliminar) se pueden enjuagar y luego sumergido en la solución RNAlater (Ambion) durante la disección de los tejidos específicos de extracción de RNA.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Reagent	Sigma-Aldrich	A5040
PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)	Reagent	Mediatech, Inc.	46-013-CM
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P-6148
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787
Alexa Fluor 488 phalloidin	Reagent	Invitrogen	A12379
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI	Reagent	Vector Laboratories	H-1500
Dissection microscope	Microscope	Nikon Instruments	SMZ1000
Insect pins	Tool	Fine Science Tools	26000-40
Scissors	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5880
Tweezers	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045
Needle blade	Tool	Sharpoint	78-6810
Fluorescent microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
Dissection pad	Tool	eNasco	SB07840M
Zebrafish	Animal	Various	n/a