Cerebro del pez cebra ventrículo inyección

Summary

Después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se contrae y se dobla mientras que el tubo se llena de líquido cefalorraquídeo embrionarias (ECSF) para formar los ventrículos del cerebro embrionario. Hemos desarrollado esta técnica de inyección del ventrículo para visualizar mejor el espacio lleno de líquido, en contraste con la forma neuroepitelial en un embrión vivo.

Abstract

Adecuada formación del ventrículo del cerebro durante el desarrollo embrionario del cerebro es necesaria para la función normal del cerebro. Ventrículos del cerebro son las cavidades altamente conservada dentro del cerebro que están llenas de líquido cefalorraquídeo. En el pez cebra, después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se somete a una serie de constricciones y pliegues, mientras que se llena de líquido que resulta en la formación del cerebro del ventrículo. A fin de comprender el proceso de formación del ventrículo izquierdo, y los cambios de forma neuroepitelial que se producen al mismo tiempo, necesitamos una manera de visualizar el espacio ventricular en comparación con el tejido cerebral. Sin embargo, la naturaleza de los embriones de pez cebra transparente hace que sea difícil diferenciar el tejido del espacio ventricular. Por lo tanto, hemos desarrollado un ventrículo cerebral técnica de inyección, donde se llena el espacio ventricular con un tinte fluorescente y la imagen por microscopía de campo claro y fluorescencia. El claro y las imágenes fluorescentes se procesan y se superponen en Photoshop. Esta técnica permite la visualización del espacio ventrículo con el colorante fluorescente, en comparación con la forma de la neuroepithelium en la imagen de campo claro. Inyección cerebral ventrículo en el pez cebra puede ser empleado de 18 horas después de la fecundación a través de las primeras etapas larvales. Hemos utilizado esta técnica ampliamente en nuestros estudios de la formación del cerebro del ventrículo y la morfogénesis, así como en la caracterización de mutantes del cerebro morfogénesis (1-3).

Protocol

Protocolo

Parte 1: Preparación para la microinyección

1. Prepararse para la inyección tirando de agujas capilar mediante Sutter extractor aguja Instruments.
2. Llene la aguja con un tinte fluorescente (como Texas-Red Dextran).
3. Monte la aguja en un aparato de micromanipulador y microinyección.
4. Corte la aguja del tamaño apropiado en un ángulo para crear una punta biselada.
5. Mida el tamaño de la gota y comprobar que está entre 1-2NL por inyección de aceite.

Parte 2: Preparación de los embriones

1. Inyectar a los embriones 30 minutos antes de la etapa de interés. Por ejemplo, para estudiar los ventrículos a las 24 horas posteriores a la fecundación (HPF), inyectar a los embriones en el 23,5 HPF. Etapa los embriones de acuerdo a Kimmel et al. (4).
2. Bajo el microscopio estereoscópico, quite cuidadosamente el corion de los embriones con unas pinzas.
3. El uso de un plato de plástico recubiertas con agarosa al 1%, perfore la agarosa con un plástico de 100 a 200 l punta de la pipeta. Con cuidado, retire los tapones de agarosa de los orificios con unas pinzas.
4. La transferencia de los embriones en los medios de comunicación del embrión en el plato de agarosa con agujeros.
5. Añadir tricaína (conforme a las Westerfield (5)) a los medios de comunicación para anestesiar a los embriones y evitar el movimiento durante el experimento.
6. Con cuidado, coloque la cola del embrión hacia abajo en el hoyo, y orientarla de modo que el aparato de inyección está en el lado posterior del embrión.

Parte 3: La inyección del ventrículo cerebral

1. Para inyectar el ventrículo cerebral, arreglar la configuración de micromanipulación de modo que la punta de la aguja está en el mismo campo de visión como el embrión de alta potencia.
2. Con cuidado, colocar la aguja a través de la roofplate delgada de la parte posterior del cerebro justo detrás del hingepoint r0/r1 sin tocar el tejido cerebral a continuación.
3. Inyectar medio de contraste suficiente para llenar por completo los ventrículos. Puede tomar varias inyecciones para rellenar el espacio del ventrículo izquierdo, dependiendo de la etapa del embrión.

Parte 4: Imágenes

1. Con un paño limpio 1% de agarosa recubiertas plato, hacer agujeros nuevos en el plato, retire los tapones, y añadir tricaína para anestesiar a los embriones y evitar el movimiento.
2. Coloque la cola del embrión ventrículo-se inyecta en el agujero y la posición de una imagen dorsal.
3. Tomar una imagen con luz transmitida.
4. Es muy importante para no mover el embrión o el microscopio.
5. Cambie la configuración en el microscopio y tomar una imagen con luz fluorescente.
6. Vuelva a colocar el embrión para tomar imágenes con los dos laterales de luz transmitida y luz fluorescente.
7. Guarde las imágenes como archivos TIFF para el procesamiento de imágenes en Photoshop.

Parte 5: Procesamiento de Imágenes

1. Para procesar las imágenes en Photoshop, abra la luz transmitida y fluorescencia imágenes de luz del mismo embrión adoptado en la misma posición. Asegúrese de que todas las opciones son las mismas para cada imagen.
2. Arrastre su imagen fluorescente en la imagen de luz transmitida y alinearlos con exactitud.
3. Con la imagen fluorescente, seleccione "Imagen", "Ajustes", y luego "Reemplazar color" y cambiar el fondo negro a blanco.
4. En el "Reemplazar color" ventana de ajustar la "confusión" factor de la derecha hasta que las imágenes fluorescentes se ve de color uniforme.
5. En la sección "Capas", seleccione "Multiplicar" para ver las imágenes superpuestas. La imagen de su espacio ventrículo debe coincidir con la imagen de luz transmitida con exactitud.
6. Guarde este archivo y repita para otras imágenes.

Resultados representante / Resultados

Adecuada las imágenes de la inyección del ventrículo se muestran en la Figura 1 paneles de AD, mientras que un ejemplo de las imágenes de la inyección incorrecta se muestran en la EH. Inyecciones adecuadas tienen bordes afilados y el tinte no difuso. Inyección incorrecta, que se produce cuando se inserta la aguja demasiado lejos hacia el ventrículo y golpea el tejido cerebral a continuación, puede resultar en medio de contraste que es visible fuera del espacio ventricular y en la yema.

Figura 1. Ventrículo inyecciones de 25 embriones de tipo salvaje HPF. (AD) y el método de inyección correcta (EH) método de la inyección incorrecta se muestran como ejemplos. (A, E) imágenes de campo claro dorsal con sus correspondientes imágenes fluorescentes (B, F) y la superposición de las imágenes de fluorescencia y campo claro (C, G) para los métodos de inyección correctas e incorrectas se muestran. Las flechas indican las regiones donde colorante ha ido más allá del espacio ventricular cerebral debido a una inyección del ventrículo incorrecta (consulte la sección "Solución de problemas"). Anterior está a la izquierda en todas las imágenes.

Solución de problemas:

Problema Causa	Remedio
Usted está aplastando el embrión con la aguja.	Su aguja es demasiado contundente, o la punta es demasiado grande.	Comience con una aguja nueva y no se rompen tan lejos. El bisel de la aguja para que sea fuerte como una aguja de la jeringa.
El medio de contraste es en todo el embrión y la yema (Fig. 1E-H).	La aguja fue a través del tejido y no permanecer en el espacio ventricular.	Su aspiración podría no ser lo suficientemente aguda, por lo que son incapaces de controlar la velocidad de la punción.
El medio de contraste es demasiado débil o no en el cerebro anterior.	Que no ha utilizado una presión lo suficientemente alta como para la inyección o la aguja no estaba lo suficientemente anterior para alcanzar el cerebro anterior, cuando se inyecta el medio de contraste.	Aumento de la presión de inyección o colocar su aguja un poco más anterior durante la inyección. Usted puede poner la aguja a través de la frontera del cerebro medio-hindbrain si se requiere más detalle en el cerebro anterior. También puede simplemente esperar un poco para el tinte de difundir aún más antes de exponer.
Las imágenes fluorescentes son oscuros alrededor de los bordes después de la sustitución del color en Photoshop.	Se olvidó de cambiar el "confusión" en la ventana de configuración de reemplazar color.	Mueva la "confusión" todo el camino a la derecha de la ventana de reemplazar color.
La aguja no se pinche la roofplate rombencéfalo.	La aguja no se corta correctamente.	Hacer una nueva aguja. Si usted está haciendo una gran cantidad de inyecciones puede que tenga varias agujas, ya que pueden conseguir aburrido.

Discussion

En este video se muestra cómo inyectar un colorante fluorescente (Texas-Red dextrano) en el desarrollo de los ventrículos del cerebro del pez cebra. Este método se utiliza para visualizar el espacio ventrículo del cerebro, en contraste con el neuroepitelio rodea y es extremadamente útil para determinar la forma del espacio ventricular, así como la forma del tejido cerebral circundante. Nos permite entender mejor el proceso de formación del cerebro del ventrículo y la morfogénesis del cerebro a través del tiempo en el embrión vivo. Esta técnica es una excelente herramienta para estudiar el cerebro defectos de ventrículo formación y para la caracterización inicial y el estudio de los mutantes de la morfogénesis del cerebro.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)