Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).
Abstract
In questo protocollo si descrivono l'uso della microscopia a fluorescenza Speckle (FSM) di catturare immagini ad alta risoluzione delle dinamiche di actina in cellule PtK1. Un vantaggio unico del FSM è la sua capacità di catturare il movimento e la cinetica fatturato (montaggio / smontaggio) della F-actina rete all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica è particolarmente utile nel derivare misurazioni quantitative di F-actina dinamiche se abbinato con il software di visione artificiale (qFSM). Descriviamo la, microiniezione selezione e la visualizzazione di sonde fluorescenti actina in cellule viventi. È importante sottolineare che le procedure siano applicabili alla visualizzazione assemblee macomolecular altri. FSM è stata dimostrata per microtubuli, filamenti intermedi, e complessi di adesione.
Protocol
Sezione 1: Ottenere il vostro actina fluorescente per FSM Materiali richiesti: purificato actina, fluoroforo (Alexa, X-rodamina consigliato). G-buffer, ultracentrifuga Un componente chiave per l'acquisizione di filmati FSM buona impone l'etichettatura corretta di actina (o altre proteine del citoscheletro) con il fluoroforo di vostra scelta. Si consiglia di utilizzare fluorofori di Alexa (488, 568 lunghezze d'onda) e X-rodamina derivati esteri succin…
Discussion
Diversi sono i fattori chiave fondamentale per riuscire a ottenere immagini speckle, per quanto buone macchioline iniziano e terminano con la qualità della vostra actina fluorescente. Un rapporto di etichettatura elevati di colorante di actina monomero, disposti intorno a 0,4-0,7 farà in modo che puntini apparirà luminoso e discreto, mentre la proteina etichettata stesso dovrebbe essere solubile e priva di aggregati. Altrettanto importante è la procedura di microiniezione. Per assicurare la normale omeostasi cellula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo sviluppo di qFSM è finanziato dalla sovvenzione NIH U01 GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).