الاختيار ، microinjection ، والتصوير من fluorescently المسمى F – أكتين عبر الفلورسنت رقطة المجهري (FSM).
Abstract
في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM) لالتقاط صور عالية الدقة للديناميات أكتين PtK1 في الخلايا. وهناك ميزة فريدة من FSM هو قدرته على التقاط الحركة ودوران حركية (التجميع / التفكيك) من شبكة من طراز F – أكتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في القياسات الكمية المستمدة من طراز F – أكتين ديناميات عندما يقترن برامج الكمبيوتر الرؤية (qFSM). نحن تصف التحديد ، والتصور microinjection تحقيقات أكتين الفلورية في الخلايا الحية. الأهم من ذلك ، إجراءات مماثلة تنطبق على تصور macomolecular الجمعيات الأخرى. وقد ثبت عن FSM ميكروتثبول ، خيوط وسيطة ، والمجمعات الالتصاق.
Protocol
المادة 1 : الحصول على أكتين الخاص fluorescently المسمى لFSM المواد المطلوبة : تنقية أكتين ، fluorophore (اليكسا ، X – رودامين مستحسن). G – العازلة ، نابذة فائقة السرعة ومن المكونات الرئيسية لاكتساب …
Discussion
عدة عوامل رئيسية هي حاسمة لنجاح رقطة الحصول على الصور ، الرقطة جيدة ولكن تبدأ وتنتهي مع نوعية أكتين الخاص fluorescently المسمى. وهناك نسبة عالية من العلامات صبغ لمونومر أكتين ، بتعيين حوالي 0،4-0،7 ضمان الرقطة ستظهر مشرق ومنفصلة ، في حين أن البروتين المسمى ذاتها ينبغي أن تكون…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل تطوير qFSM من U01 منحة المعاهد الوطنية للصحة GM06230.
Materials
Injection buffer (IB)
50 mM potassium glutamate
0.5 M MgCl2 (APPENDIX 2A)
Store up to 2 years at −20° C
G-buffer
2 mM Tris⋅Cl, pH 8.0 (APPENDIX 2A)
0.2 mM CaCl2 (APPENDIX 2A)
Add just before use:
0.2 mM ATP (see recipe for 100 mM)
0.5 mM 2-mercaptoethanol
Lim, J., Danuser, G. Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM). J. Vis. Exp. (30), e1325, doi:10.3791/1325 (2009).